用于檢測家蠶蠶卵微孢子蟲的lamp引物及快速檢測方法
【技術領域】
[0001 ]本發明設及生物技術領域，更具體地，設及一種家蠶蠶卵微抱子蟲的LAMP檢測引 物及其應用和家蠶蠶卵微抱子蟲的LAMP快速檢測方法。
【背景技術】
[0002] 家蠶微粒子病是病原性的家蠶微抱子蟲(Nosema bombycis，N.b)經食下傳染或胚 卵（胎)傳染，使家蠶感染發病的一種毀滅性疫病，也是目前影響我國蠶絲業持續穩定發展 的重要疫病，每年各地因微粒子病危害而造成的經濟損失十分慘重。同時，野外昆蟲微抱子 蟲可交叉感染家蠶，并能在蠶體間W及不同蠶期間傳播，導致大批蠶種報廢，嚴重制約蠶種 貿易和蠶業可持續發展。各地區蠶業主管部口和相關生產單位投入大量人力、物力和財力， 采取傳統顯微鏡鏡檢母蛾，淘汰帶毒母蛾產下的蠶種的常規方法進行防治家蠶微粒子病， 但效果不佳。我國將家蠶微粒子病列為進出口動物檢疫二類疫病的檢疫名錄。
[0003] 最初人們判別家蠶是否感染家蠶微粒子病主要根據顯微鏡下組織研磨液中的微 抱子蟲的形態和大小進行的，運種方法也有效地遏制了世界各地蠶區微粒子病的流行，捶 救了世界的養蠶業。而對于家蠶蠶卵微抱子蟲的檢測主要是通過將產卵24h后的蠶卵浸酸 處理，待蠶卵解化收蟻后進行顯微鏡檢測，運種方法不僅耗費了大量時間，而且顯微鏡鏡檢 的缺點是對操作人員的技術及經驗要求較高，且很難將其他抱子類似物與家蠶微抱子蟲抱 子區別開來。隨著PCR技術的普及，人們開始使用PCR方法來檢測家蠶微抱子蟲并且達到了 較高的靈敏度。目前用于家蠶微粒子病PCR檢測的引物多是針對祀基因 SS化RNA的(Ter巧R S,Smith JE,Bouchon D,et al.Ultrastructural characterization and molecular taxonomy of Nosema granulosis sp.n.,a transovarially transmitted,feminizing (TTF)microsporidium.J.Eukaryot.Microbiol.1999,(46):492-499;Huang Wei-Fone, Tsai Shu-Jen,Lo Chu-Fang,et al.The novel organization and complete sequence of the ribosomal RNA gene of Nosema bombycis.Fungal Genetics and Biology, 2004.4U5) :473-481)但是劉吉平等(2004K劉吉平，曹陽，Smith J.E.等.模擬感染家蠶微 粒子病的PCR分子診斷技術研究.中國農業科學，2004,37( 12): 1925-1931)研究發現，基 于ieSrDNA保守區段設計的引物檢測蠶卵微抱子蟲，經常會有非目的條帶及假陽性結果出 現，推測蠶卵抽提物中可能存在某種抑制物質干擾了對病原微抱子蟲基因組DNA有效擴增。
[0004] 本申請人根據長期的研究實驗結果，針對家蠶微抱子蟲轉錄組測序的結果，經測 序驗證發現了家蠶微抱子蟲S邱tin2基因（登錄號:KJ451481.1)，發現WS邱tin2基因為祀 序列設計的PCR引物檢測微抱子蟲并無非特異性條帶及假陽性結果。但是，使用該基因設計 的PCR引物對于家蠶微抱子蟲檢測方法操作步驟較多，且花費時間較長。況且，微抱子蟲寄 生于蠶卵中，且蠶卵含量明顯高于要檢測的微抱子蟲，在提取獲得的DNA樣品中，兩者DNA同 時存在，家蠶蠶卵DNA對檢測造成嚴重的干擾，因此，要想直接W蠶卵DNA為模板進行微抱子 蟲的LAMP檢測，對檢測提出了更高的要求。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題是針對現有技術中檢測蠶卵中是否感染家蠶微抱子蟲 所存在的操作步驟多、花費時間長、干擾大等缺陷，設計出一組適用于家蠶蠶卵微抱子蟲的 LAMP檢測的檢測引物，基于所述引物，可成功建立家蠶蠶卵微抱子蟲的LAMP檢測方法。
[0006] 本發明要解決的另一技術問題是提供一種家蠶蠶卵微抱子蟲的LAMP快速檢測方 法。
[0007] 本發明的目的通過W下技術方案予W實現：
[000引提供一組用于檢測家蠶蠶卵微抱子蟲的LAMP引物，所述引物為Septin2-F3、 S邱tin2-B3、S巧tin2-FIP(Flc+F2)和S邱tin2-BIP(Blc+B2)，其序列分別如沈Q ID N0:1 ~ 4所示。
[0009] SEQ ID NO: 1:
[0010] Septin2-F3：5'-CCAATTTCACACCTCCGTT-3'
[0011] 沈Q ID NO:2
[0012] Septin2-B3:5'-ACACAAGCTCTAAATCGGTC-3 '
[0013] SEQ ID NO:3:
[0014] Septin2-FIP(Flc+F2)：
[0015] 5，-GTAAGTTTAATTGGCCCCAGGGATATTGTAACATCACCAAAAATAACCG-3,
[0016] SEQ ID N0：4：
[0017] Septin2-BIP(Blc+B2)：
[001 引 5'-GTTTAGGCTAAGGGAAATGCTTGTATAATATTCTTCTGTGGTTTCGA-3'
[0019] 在本發明方法的關鍵技術之一是引物的設計，基于引物的科學設計，才能成功實 現操作步驟少、花費時間短、干擾小、特異性強的LAMP檢測，本申請人根據Septin2基因設計 了若干組引物，經過復雜和困難的篩選工作，并對運些引物的有效性、特異性、反應時間等 反復進行了分析、總結和模擬實驗，綜合考慮檢測方法的各種影響因素，才確定所述適用于 家蠶蠶卵微抱子蟲的LAMP檢測的檢測引物。
[0020] 本發明同時提供一種家蠶蠶卵微抱子蟲的LAMP檢測方法，包括W下步驟：
[0021] SI.提取待測樣品模板DNA;
[0022] S2.基于所述檢測引物，配置反應體系；
[0023] S3.在步驟S2所配置的反應體系使用的反應管中加入20化密封液;采用染色法判 定結果在管蓋內側加入化L顯色液；
[0024] S4.反應:將反應管置于恒溫水浴箱或其他恒溫設備中，63 °C恒溫放置60min;然后 95°C，放置2min滅活；
[00巧]S5.結果判定：
[0026] 采用染色法進行結果判定:將反應管管蓋內側的顯色液彈入反應管，與反應產物 混合;在自然光下通過肉眼觀察顏色變化，反應產物顏色變為綠色，說明待測樣品含有家蠶 蠶卵微抱子蟲;反應產物變為澄色，則不含有家蠶蠶卵微抱子蟲；
[0027] 或者采用瓊脂糖凝膠電泳法進行結果判定：取化L反應后的產物，與IiiL 6 X loading buffer和化Ld地2〇混合，于2%瓊脂糖凝膠電泳；若出現大小不等的眾多梯形條 帶，說明待測樣品含有家蠶蠶卵微抱子蟲;若無大小不等的眾多梯形條帶，說明待測樣品不 含有家蠶蠶卵微抱子蟲；
[0028] 或者采用實時巧光法進行結果判定:若有"S"型擴增曲線且擴增值超過設定的闊 值為陽性，若擴增曲線的擴增值未超過設定的闊值則為陰性。
[0029] 其中，S2所述的反應體系是采用優化后的25化反應體系，分別如下：
[0030] (1)采用染色法進行結果判定的25iiL反應體系為：
[0031] 在PCR管中配置，采用優化后的25iiL反應體系，如下表所述：
[0032]
[00：
[0034] 建議:對于N個樣品，應配制(N+3)倍體積的反應液(包括陰性對照、陽性對照各一 個，W及分裝耗費誤差），保證各反應管分裝均勻。
[0035] (2)實時巧光法判定結果
[0036] 在PCR管中配置，采用優化后的25iiL反應體系，如下表所述：
[0037]
[0038] (3)瓊脂糖凝膠電泳法判定結果
[0039] 在PCR管中配置，采用優化后的25iiL反應體系，如下表所述：
[0040]
[004U 所述2 X Reaction Mix為反應緩沖液，組成為20mMTris-HCl，pH8.8 ; IOmMKCl; 2mMMgS04; 20mM(NH4)2S04; 0.1 % Tri ton X-IOO; 2. SmMdNTPs; IM甜菜堿；25mMMgCl2;
[0042] 所述 Septin2-F3/B3 為 5pmol/化；所述 Septin2-FIP/BIP 為 20 ~40pmol/化；所述 Bst DNA polymerase為8U/]iL。
[0043] 陽性對照品為S邱t in2DNA-pMD重組質粒。
[0044] 所述顯色液為10000 X SYBR Green I;所述巧光指示劑為IX SYBR Green I。
[0045] 步驟SI用Qiagen公司出品的試劑盒DNeasy Plant Mini