一種酶法制備稀有人參皂苷Rh1的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥領域，涉及稀有人參皂苷Rhl的制備方法，尤其涉及利用重組表達的來源于α-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶轉化人參皂苷Re生成Rhl。
【背景技術】
[0002]人參(Panaxginseng)是亞洲傳統的名貴中藥材，人參皂苷是其主要的生物活性物質，具有生物活性顯著、藥理作用獨特等特點。隨著分析技術水平的提高，人參皂苷的化學成分得到了進一步的明確，現已經分離鑒定出180余種人參皂苷單體，其中5種主要皂苷(人參皂苷Rb 1、Rb2、Re、Re和Rg I)占總皂苷的80 %以上，而人參皂苷(Rg3、Rh2、Compound K、Rg2、Fl和Rhl)含量很低，稱為稀有阜苷(Applied Microb1logy and B1technology,2012，94:673-682)，但其藥理活性優于上述高含量的人參皂苷。
[0003]稀有皂苷Rhl具有啟動和增強免疫應答，促進肝細胞增殖、殺傷腫瘤細胞，以及抗老化等生理作用，可用于調節機體免疫功能，治療和預防肝炎等。但稀有皂苷Rhl在植物中含量很低，直接提取工藝復雜，成本太高。而人參皂苷Re在人參總皂苷中含量較高，與稀有人參皂苷Rhl具有相似的化學結構，因此，可以通過對人參皂苷Re進行轉化得到Rhl (圖1)，但需要特異性的降解C20位上的鼠李糖基和C6位上的葡萄糖基。
[0004]利用化學法和生物轉化法可以將人參皂苷Re轉化為Rhl。但化學轉化法因其反應劇烈、選擇性差、副產物多等缺點而不被采用。生物轉化具有反應條件溫和，特異性好等特點而受到青睞。目前人參皂苷的生物轉化法主要有微生物轉化法和酶轉化法。微生物轉化法因其轉化體系復雜，容易產生副產物，對產品的純度有一定影響。如，董阿玲等發現黑曲霉和藍色犁頭霉能轉化人參皂苷Rgl生產人參皂苷Rhl，但存在轉化周期較長，且有其它皂苷副產物等缺點(中國藥物，2001，10(3): 115-118)。酶法轉化能避免微生物轉化法的缺陷，但各種酶對底物的專一性不同，降解的糖苷鍵類型也各不相同，因此，尋找能高效、特異性降解人參皂苷Re生產人參皂苷Rhl的糖苷水解酶成為了研究關鍵。目前，還沒有利用酶轉化人參皂苷Re生產人參皂苷Rhl的報道。
【發明內容】
[0005]解決的技術問題:本發明提供了一種酶法制備稀有人參皂苷Rhl的方法，該方法所使用的重組酶分別來源于Thermotoga petrophila的β-葡萄糖苷酶和黑曲霉(AspergiIIusniger)的α-鼠李糖苷酶。
[000?] 技術方案:一種酶法制備稀有人參阜苷Rh I的方法，利用來源于Thermo togapetrophila的β-葡萄糖苷酶和黑曲霉(AspergilIus niger)的α-鼠李糖苷酶，降解人參阜苷Re生產Rhl。
[0007]所述β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0008]所述α-鼠李糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQ ID Ν0:4所示。
[0009]所述β-葡萄糖苷酶是通過重組表達制備的，步驟為:
[0010](I)以提取的Thermotoga petrophila基因組DNA為模板，用具有SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列為上游引物和具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列為下游引物，PCR擴增得到β-葡萄糖苷酶的DNA分子；
[0011](2)將上述β-葡萄糖苷酶的DNA分子和pET-20b分別用Nde I和Xho I進行雙酶切，連接并轉化得到含有葡萄糖苷酶的DNA分子的重組質粒；
[0012](3)將上述獲得的重組質粒轉化表達宿主Ε.coli BL21(DE3)，IPTG誘導β-葡萄糖苷酶表達，收集菌體，破碎細胞，80 0C熱處理40分鐘，獲得純化的β_葡萄糖苷酶。
[0013]所述α-鼠李糖苷酶是通過重組表達制備的，步驟為:
[0014](I)以提取的黑曲霉(Aspergillus niger)NL_lcDNA為模板，用具有SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列為上游引物和具有SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列為下游引物，PCR擴增得到α-鼠李糖苷酶的DNA分子；
[0015](2)將上述β-葡萄糖苷酶的DNA分子和pET_20b分別用Nde I和Xho I進行雙酶切，連接并轉化得到含有α_鼠李糖苷酶的DNA分子的重組質粒；
[0016](3)將上述獲得的重組質粒轉化表達宿主Ε.coli BL21(DE3)，誘導α-鼠李糖苷酶表達，收集菌體，破碎細胞，離心獲α_鼠李糖苷酶。
[0017]所述酶法制備稀有人參皂苷Rhl的方法中的降解條件為:
[0018](l)lg/L人參皂苷Re，i3_葡萄糖苷酶0.2U，pH 5.0，85°C條件下，降解Ih;
[0019](2)將上述反應液加入α-鼠李糖苷酶6.6U，調整pH為6.5，35°C條件下，降解Ih，最終可以將人參皂苷Re轉化為人參皂苷Rhl，摩爾得率為95%。
[0020]有益效果:1.通過酶法催化人參皂苷Re生產稀有人參皂苷Rhl，生成的稀有人參皂苷Rhl純度高，沒有副產物。2.酶法轉化的效率高，摩爾得率達到95%。
【附圖說明】
[0021]圖1是人參皂苷Re和Rhl的結構示意圖；
[0022]圖2是本發明實施例提供的溫度對β-葡萄糖苷酶活性的影響圖；
[0023]圖3是本發明實施例提供的pH對β-葡萄糖苷酶活性的影響圖；
[0024]圖4是本發明實施例提供的Re轉化生成Rg2的時間曲線圖；
[0025]圖5是本發明實施例提供的溫度對α-鼠李糖苷酶活性的影響圖；
[0026]圖6是本發明實施例提供的pH對α-鼠李糖苷酶活性的影響圖；
[0027]圖7是本發明實施例提供的Rg2轉化生成Rhl的時間曲線圖。
【具體實施方式】
[0028]下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅為本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0029]為了進一步理解本發明，下面結合實施例對本發明進行詳細闡述，其中，如無特殊說明，實施例中涉及的各種反應試劑均可以通過商業渠道購買得到;如無特殊說明，實施例中涉及的具體操作參見《分子克隆實驗指南第三版》。
[0030]實施例1:重組質粒pET-20b_bgl的構建[0031 ] 1.1 Thermotoga petrophila的培養
[0032]Thermotoga 口61^0口11；[1&購于03]\12菌種保藏中心(www.dsmz.de)編號為D SM13995 ο其培養基配方為:10g/L可溶性淀粉，3g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨，5g/L肉浸液，10g/L2-嗎啉乙磺酸，10mg/L七水合硫酸鐵，lmg/L刃天青，調pH為7.2，煮沸充氮氣，除去氧氣后，培養基在無氧條件下裝入厭氧瓶滅菌。用注射器按照0.5wt接種量接種，85°C靜止培養24h，收集細胞。
[0033]1.2基因組DNA的提取
[0034](I)靜置培養Thermotoga petrophila 24h，取30mL菌液4，000g離心1min收集細胞。
[0035](2)用9.5mL TE緩沖液重懸菌體，加入0.5mL 1wt.%十二烷基硫酸鈉(SDS)和50μL蛋白酶K(20mg/mL)，混合均勻，37°C保溫Ih。
[0036](3)加入 1.8mL 5mol/L NaCl，1.5mL十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)/NaCl，混勻，65°C 溫育 20min。
[0037](4)加入等體積氯仿/異戊醇(體積比24:1)，混勾，6，000g離心lOmin。
[0038](5)為防止剪切力造成基因組DNA斷裂，用粗口吸管將上清轉入另一離心管中，加入等體積酸/氯仿/異戊醇混勾(體積比25:24:1)，6，OOOg離心1min。
[0039](6)另一離心管中，加入0.6倍體積異丙醇，輕輕晃動至白色絲狀DNA沉淀清晰可見。
[0040](7)用吸管將DNA纏繞其上，在70vt.%酒精中清洗。
[0041 ] (8)用無菌牙簽將DNA從吸管上刮下，轉入1.5mL離心管中。
[0042](9)室溫下風干，加500yL TE緩沖液溶解。
[0043 ] (10)取50yL用核酸蛋白檢測儀檢測DNA濃度。
[0044]1.3重組質粒pET-20b_bgl的構建
[0045]按照已知的Thermotoga petrophila極耐熱β-葡萄糖苷酶基因(YP_001244492.1)設計引物:(SEQ ID NO:5)下劃線表示Nde I酶切位點；(SEQ ID NO:6)下劃線表示Xho I酶切位點，并去除終止密碼子；以提取的Thermotoga petrophila的基因組DNA為模板，用合成的引物進行PCR擴增，擴增的條件是94°C，3min ； 30次循環(94°C，30s ; 58°C，30s ; 72°C，2min I Os); 72 °C，I Omin;反應停止，4 °C保溫。通過凝膠回收試劑盒對PCR擴增產物進行純化。得到T.petrophila極耐熱β-葡萄糖苷酶基因。
[0046]得到Thermotoga petrophila極耐熱β-葡萄糖苷酶基因和pET_20b分別用Nde I和Xho I進行雙酶切，并分別割膠回收，濃縮后16°C連接過夜，將連接產物轉化大腸桿菌ToplOF’感受態細胞，轉化產物涂布到LB(添加氨芐青霉素至終濃度100mg/L)固體培養基上37°C過夜培養，接種幾個單菌落到LB(添加氨芐青霉素至終濃度100mg/L)液體培養基中培養8-10小時后，收集菌體提取質粒，酶切驗證去除空載質粒，將重組質粒進行核酸序列測定，得到正確的重組表達載體pET20b-bgl。
[0047]2.重組極耐熱β_葡萄糖苷酶的表達及純化
[0048]將重組質粒pET-20b-bgl轉化大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌(Novagen)，在含有Amp(100yg/mL)的LB平板(LB培養基:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，瓊脂15g/L)上經過37 °C培養過夜，挑轉化子到200mL的LB培養基中(100yg/mL Amp)37°C，200rpm振蕩培養至OD6OO為0.6時，加入終濃度為0.5mM異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導劑，30 °C誘導培養8h，用高速冷凍離心機將培養液在4 °C下，以13，OOOrpm離心15min，收集菌體，去上清加入無菌水，超聲波破碎細胞，隨后70°C熱處理30min，用高速冷凍離心機將培養液在4°C下，以13，OOOrpm離心15min，上清即為重組極耐熱β_葡萄糖苷酶的純酶。
[0049]3.重組極耐熱β_葡萄糖苷酶轉化Re為Rg2的條件
[0050]3.1酶活測定
[0051 ]反應體系200yL，10yL 20mmol/LPNPG中加入10yL 100mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 5.0)和適量的水，先在90 0C孵育2min，再加入5yL酶液(稀釋到合適的倍數)反應lOmin。反應結束后立刻加入600yL IM的Na2CO3,用分光光度計在405n