子培養基（葡萄糖20g/L，酵母粉lOg/L，蛋白腺lOg/L)中，30°C， 20化pm振蕩培養2她，得種子液，得產油微生物種子液；
[0087] 3)向水解液中接入產油微生物種子液，接種量2% (v/v)，在30°C下通氣培養16化；
[0088] 4)終止發酵，此時發酵液中殘余木糖0.5g/M固液分離得干菌體24.1g/L，油脂量 15.6旨/1，油脂含量64.8%。
[0089] 5)堿催化轉醋化:對獲得的油脂，加入1.5 %KOH-甲醇溶液250mL，65 °C下反應化， 加入正己燒萃取生物柴油，靜置，上層蒸發除正己燒收獲生物柴油，得率為94%;下層獲得 含堿催化劑、副產物甘油和未反應甲醇的溶液，調整S者的相對比例，再循環用于木質纖維 素的預處理。
[0090] 實施例9
[0091] 1)柳枝稷預處理及水解液的制備：稱取100g過20目篩的柳枝稷，加入675g化OH-甘油-甲醇溶液(化OH lOg，甘油30g，甲醇600g)，固液比15% (w/w)，于預處理罐中180°C處 理15min;原位蒸發及冷凝回收甲醇，加水調整固液比至10% (w/w)，加此S化調整pH至4.8，添 加纖維素酶15FPU/g、e-葡萄糖巧酶30CBU/g和木聚糖酶lOOU/g，于水浴搖床中50°C、200巧m 水解72h，得水解液;水解液煮沸lOmin，真空抽濾得水解上清液，其中葡萄糖、木糖和甘油濃 度分別為36. lg/L、21.5g/L和29.4g/L，C/N比72，調整抑至6.0后于121°C滅菌15min后備用；
[0092] 2)彎曲隱球酵母Cryptococ州S curvatus ATCC 20509(購自美國典型培養物保藏 中屯、）接種在種子培養基(甘油20g/L，酵母粉5g/L，蛋白腺3g/L)中，28°C，200rpm振蕩培養 2地，得產油微生物種子液；
[0093] 3)向水解液中接入產油微生物種子液，接種量5 % (v/v)，在28 °C下通氣培養18化；
[0094] 4)終止發酵，此時發酵液中殘余甘油1.5g/l;固液分離收集菌體，得干菌體28. Ig/ 1，油脂量16.5旨/1，油脂含量58.7%(>/訊）。
[00巧]5)堿催化轉醋化:對獲得的油脂，加入1 %化OH-甲醇溶液1000 mL，70°C下反應化， 加入正己燒萃取生物柴油，靜置，上層蒸發除正己燒收獲生物柴油，得率為94%;下層獲得 含堿催化劑、副產物甘油和未反應甲醇的溶液，調整S者的相對比例，再循環用于木質纖維 素的預處理。
[0096] 實施例10
[0097] 1)甜高梁渣預處理及水解液的制備：稱取50g過40目篩的甜高梁渣，加入250g KOH-甘油-甲醇溶液化OH Sg，甘油20g，甲醇200g)，固液比20% (w/w)，于預處理罐中120°C 處理化;原位蒸發及冷凝回收甲醇，加水調整固液比至15% (w/w)，加此S〇4調整抑至4.8，添 加纖維素酶25FPU/g、e-葡萄糖巧酶50CBU/g和木聚糖酶lOOU/g，于水浴搖床中50°C、200巧m 水解72h，得水解液;水解液煮沸lOmin，真空抽濾得水解上清液，其中葡萄糖、木糖和甘油濃 度分別為52 . Ig/L、34.5g/L和58.6g/L，C/r^比132，調整抑至9.0后于115°C滅菌30min后備 用；
[0098] 2)發酵性絲抱酵母IYichosporon fermentans CICC 1368(購自中國工業微生物 菌種保藏管理中屯、)接種在種子培養基(甘油20g/L，酵母粉lOg/L，蛋白腺20g/L)中，32°C， 20化pm振蕩培養2她，得產油微生物種子液；
[0099] 3)向水解液中接入產油微生物種子液，接種量12 % (v/v)，在32°C下通氣培養 144h；
[0100] 4)終止發酵，此時發酵液中殘余甘油2.7g/L，最終得干菌體40.7g/L，油脂量 27.8g/L，油脂含量68.3 % (w/w)。
[0101] 5)堿催化轉醋化:對獲得的油脂，加入2 %K0H-甲醇溶液300mL，65 °C下反應化，加 入正己燒萃取生物柴油，靜置，上層蒸發除正己燒收獲生物柴油，得率為93 % ;下層獲得含 堿催化劑、副產物甘油和未反應甲醇的溶液，調整S者的相對比例，再循環用于木質纖維素 的預處理。
[0102] 上述對比例和實施例中，油脂量乘W生物柴油得率即可得到最終的生物柴油含 量。
[0103] 上述對比例1、2和實施例1-14的結果如下表所示：
[ni CiA 1
[0105] 比較對比例1、實施例1，W及比較對比例2和實施例2的實驗結果發現，本發明將微 生物油脂經一步堿催化轉醋化制備生物柴油過程中，得到的堿催化劑-粗甘油-甲醇的混合 溶液，對木質纖維素進行預處理，再通過適量的酶進行水解，固液分離獲得水解液中，可W 得到更多量的葡萄糖和木糖，可見，通過強堿-粗甘油-甲醇混合溶液預處理木質纖維素可 深度破壞木質纖維素緊密結構，更有利于纖維素和半纖維素的酶水解。
[0106] 此外，結合實施例3-10,兩個對比例中C/^比(摩爾比)較低，而十個實施例中，由于 預處理介質中存在甘油，W及較高的糖化率，使得水解液中C/^比適中，使得最終生物量(即 干菌體含量）、油脂量產量和生物柴油產量都顯著提高，水解液中的主要碳水化合物葡萄糖 和木糖基本可被徹底利用，總的油脂得率也明顯提高。
[0107] W上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用W限制本發明，凡在本發明的精 神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種利用木質纖維素原料生產生物柴油的方法，其特征在于，所述方法包括下述步 驟： 取微生物油脂經一步堿催化轉酯化制備得到的生物柴油，加正己烷萃取并靜置分層， 上層液通過蒸發除去正己烷收獲生物柴油產品，下層液獲得含堿催化劑、副產物甘油和未 反應甲醇的混合溶液； 將木質纖維素原料與所述混合溶液按固液質量比5%~50%混合均勻，并高溫預處理， 然后原位蒸發及冷凝回收甲醇，加水至固液質量比5%~25%，采用酸中和，添加適量的木 質纖維素降解酶進行水解，固液分離后獲得水解液，調整水解液的pH值至4~9，最后滅菌處 理，所述水解液中包含有由木質纖維素降解得的可發酵性生物質糖； 取產油微生物并在種子培養基中培養，得到產油微生物種子液，將所述產油微生物種 子液接種至所述水解液中，接種量為2%_20%，于20°C_37°C通氣培養，直至發酵液中殘余 碳水化合物和甘油的濃度總和低于5g/L，終止發酵，固液分離收集產油微生物菌體，所述接 種量為體積比； 提取所述產油微生物菌體的胞內油脂，采用一步堿催化轉酯化制備生物柴油，制備得 到的生物柴油中包含堿催化劑、副產物甘油和甲醇的溶液，用于循環預處理木質纖維素。2. 如權利要求1所述方法，其特征在于，所述混合溶液中，堿催化劑為KOH或NaOH，其質 量濃度為0.2%~2%，所述副產物甘油的質量濃度為1 %~5%，甲醇的質量濃度為80%~ 90%，余量為油脂、皂、無機鹽和微量水。3. 如權利要求2所述方法，其特征在于，所述木質纖維素原料與所述混合溶液的固液質 量比10%~50%，預處理溫度為80°C~180°C，時間為15min~4h。4. 如權利要求1所述方法，其特征在于，所述木質纖維素為含有纖維素、半纖維素和木 質素的生物質材料，包括農業生物質、林業生物質、工業生物質、能源植物之一或者以上組 合。5. 如權利要求1所述方法，其特征在于，所述酸中和可采用硫酸、鹽酸、磷酸、醋酸、檸檬 酸。6. 如權利要求1-5任一項所述方法，其特征在于，所述木質纖維素降解酶為具有降低碳 水化合物聚合物的聚合度的酶，包括纖維素酶、葡萄糖苷酶、木聚糖酶、木糖苷酶、果膠 酶中的一種或一種以上的組合。7. 如權利要求1-5任一項所述方法，其特征在于，所述碳水化合物為葡萄糖和木糖，另 外還含有阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、纖維二糖和半乳糖醛酸。8. 如權利要求1-5任一項所述方法，其特征在于，所述產油微生物為經發酵培養后菌體 油脂含量可超過細胞干重20%的產油酵母，包括油脂酵母、紅酵母、絲孢酵母、隱球酵母。9. 如權利要求1所述方法，其特征在于，所述原位蒸發及冷凝回收到的甲醇用作堿催化 轉酯化的原料反復使用。10. 如權利要求1所述方法，其特征還在于:所述產油微生物菌體積累的油脂，可以作為 制備生物柴油的原料。
【專利摘要】本發明適用于生物質能源領域，提供一種利用木質纖維素原料生產生物柴油的方法，包括：將微生物油脂經一步堿催化轉酯化制備生物柴油產生的堿-甘油-甲醇混合溶液預處理木質纖維素原料；原料原位蒸發及冷凝回收甲醇后，加水至適當固液比，酸中和后添加適量的酶進行水解，固液分離獲得水解液；接入產油酵母，產油酵母利用水解液中的碳水化合物和甘油合成油脂；收集含油微生物菌體，提取胞內油脂，采用一步堿催化轉酯化制備生物柴油，加正己烷萃取，上層獲得生物柴油，下層為堿-甘油-甲醇溶液，這里堿-甘油-甲醇溶液再循環用于木質纖維素的預處理。本方法中，強堿、副產物甘油和甲醇被用于預處理木質纖維素，同時甘油還作為產油微生物的碳源被原位整合再利用，大大降低了成本，具有顯著的經濟效益。
【IPC分類】C11C3/04, C11B1/02, C11C1/08, C10L1/02, C12P7/64
【公開號】CN105695524
【申請號】CN201610263482
【發明人】龔志偉, 趙覓
【申請人】武漢科技大學, 趙覓
【公開日】2016年6月22日
【申請日】2016年4月26日