一種用于篩選具有神經保護活性的藥物的細胞模型及其用途和使用方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種用于篩選具有神經保護活性的藥物的細胞模型，屬于醫藥生物技 術領域。
【背景技術】
[0002] 隨著生命科學的快速發展，基于檢測報告基因的藥物篩選方法近年來取得了較大 的發展和廣泛的應用，其設及完整細胞，在活細胞自然條件下研究藥物對生命體功能的影 響，更接近體內的生化過程，可W較為準確地了解藥物的生物學特性。
[0003] 神經纖維性病變是世界范圍內死亡和長期殘疾的主要原因之一，但目前尚無理想 有效的治療藥物。中醫藥在神經纖維性病變病上歷史悠久，已有多種中藥單體或有效部位 W及復方制劑在防治缺血性腦血管病上具有顯著療效。但是，中藥治療神經纖維性病變的 確切療效成分及作用機制均不明確。因此構建神經保護相關的快速、分類篩選模型不僅有 助于從中藥中尋找和發現治療神經纖維性病變的有效藥物，為新藥研發提供新的先導化合 物，也可為中藥治療神經纖維性病變的作用機制研究提供一定的前期基礎，有利于中醫藥 現代化的發展。
[0004] 神經纖維性病變的有效治療主要設及機體適應神經元的保護/再生等，相關的功 能基因為神經生長因子(Nerve growth factor,NGF)eNGF具有神經元營養和促突起生長雙 重生物學功能，在神經元的損傷修復期，NGF能促進神經纖維的定向生長，促進雪旺細胞及 膠質細胞生長，修復髓銷，保護受損神經元免遭繼續損害，減少神經細胞的死亡，支持神經 元的存活。鼠NGF已成為臨床上常用的治療神經損傷的藥物。若一種物質能使NGF的表達上 調，則表明此物質很可能是一種很好的具有神經保護活性的藥物。
[0005] 盧瓊報道了基于NGF啟動子構建的藥物篩選模型，但并沒有公開所用的基因片段 的堿基序列，本領域技術人員無從知曉此篩選模型的具體結構和構建方法(盧瓊，腦缺血藥 物篩選細胞模型的構建及應用研究，西南交通大學學位論文，2014年）。
【發明內容】
[0006] 為了構建一種具有神經保護活性的藥物的篩選模型，本發明提供了一種基因構建 物。
[0007] 本發明提供的基因構建物從5'端到3'端依次含有:NGF啟動子基因-615bp~巧0 bp序列和報告基因序列。
[000引 W大鼠為例，NGF啟動子基因-615bp~巧化P序列詳見沈Q NO. 1: 進一步地，上述報告基因選自：巧光蛋白基因和/或巧光素酶基因。
[0009] 優選地，上述巧光蛋白基因為綠色巧光蛋白（GFP)基因或紅色巧光蛋白（RFP)基 因；上述巧光素酶基因為蛋火蟲巧光素酶基因。
[0010] 紅色巧光蛋白中E2-化imson較為常用。
[0011]本發明進一步提供了一種重組載體，此載體含有上述的基因構建物。
[0012]本發明中的載體指在基因工程重組DNA技術中將DNA片段（目的基因）轉移至受體 細胞的一種能自我復制的DNA分子，常用的有質粒、隧菌體和動植物病毒。
[0013] 本發明進一步構建了一種穩定的細胞，此細胞含有上述的重組載體或其基因組中 整合上述的基因構建物。
[0014] 進一步地，此細胞選自HEK293細胞、化Ia細胞、C冊細胞或干細胞中的任一種。
[0015] 本發明進一步提供了構建上述重組載體的方法，它包括如下步驟： (1) 合成NGF基因-615bp~巧Obp序列； (2) 將步驟(1)合成的序列與帶有報告基因的報告載體分別進行酶切，連接報告載體與 啟動子片段，轉化大腸桿菌，抗性篩選，挑選陽性轉化子，提取質粒，即得重組載體。
[0016] 進一步地，步驟(2)中，所述報告載體為帶有報告基因的pSC基礎質粒。
[0017] 此處所述的報告基因同上述，即選自巧光蛋白基因和/或巧光素酶基因。
[0018] 本發明進一步提供了構建上述的穩定的細胞的方法，即將上述的重組載體轉染 HEK293細胞、Hela細胞、CHO細胞或干細胞中的任一種。
[0019] 本發明進一步提供了此穩定的細胞的用途，此穩定的可用于篩選可提高NGF表達 水平或具有神經保護活性的藥物，如各類中藥、新化學實體等等。
[0020] 本發明進一步提供了一種篩選具有神經保護活性的藥物的方法，此方法包括如下 步驟： (1) 將候選藥物給予本發明構建的穩定的細胞； (2) 檢測所述細胞中報告基因的表達情況； (3) 判斷結果，若所述候選藥物能提高報告基因的表達，則表明該候選藥物可提高NGF 表達水平或具有神經保護活性。
[0021] 進一步地， 步驟(1)包括將候選藥物加入上述構建的穩定的細胞培養體系中共培養； 步驟(2)包括檢測實驗組的報告基因的表達，并與空白對照組比較，空白對照組是不添 加所述候選藥物的與實驗組相同條件培養的本發明構建的穩定的細胞； 若實驗組中報告基因的表達水平高于對照組，表明候選藥物可提高NGF表達水平或具 有神經保護活性。
[0022] 進一步優選地，實驗組的報告基因的表達水平/對照組的報告基因的表達水平> 150%，則表明候選藥物具有神經保護活性。
[0023] 本發明構建了 WNGF啟動子為祀點的細胞篩選模型，可系統、有效、多方面地篩選 具有神經保護活性的藥物，如抗神經纖維性病變的藥物。
【附圖說明】
[0024] 圖1質粒構建示意圖 圖2單克隆細胞株的構建(巧光場和明場，200X ) 圖3構建得到的穩定293-P化-E2細胞株(巧光場，100X) 圖4紅色巧光蛋白巧2)細胞模型功能鑒定(巧光場，IOOX )， A:293-p化-E2(0yM 化E);B:293-p化-E2(100yM 化E) 圖5巧光素酶細胞模型(293-p化-Luc)功能鑒定 圖6 5個中藥提取物的篩選結果。
【具體實施方式】
[00劇材料 1.1菌株與細胞株大腸桿菌菌株DH5a(四川大學國家生物醫學材料工程研究技術中屯、 505實驗室保藏）、人胚腎上皮細胞皿K293(四川大學國家生物醫學材料工程研究技術中屯、 505實驗室保藏）。
[0026] 1.2質粒PSC-E2,即連接有報告基因E2-化imson化2)(紅色巧光蛋白）的pSC質粒 (505實驗室構建）、pSC-Luc，即連接有報告基因Luciferase化UC)(巧光素酶）的pSC質粒 (505 實驗室構建）（構建方法參見 S Liu, L Ma, R Tan, et al. Safe and efficient local gene delivery into skeletal muscle viaa combination of Pluronic L64and modified electrotransfer.Gene Therapy(2014)21,558-565)。
[0027] I . 3主要試劑LA Taq 聚合酶（TaKaRa)、Pfu DM 聚合酶（Fermentas)、 Plalimum報Taq 聚合酶（Invitrogen);限制性內切酶（Fermentas) :MluI、Afl n、MunI、BamH I、NotI、Hind虹、XbaI;T4DM連接酶（TaKaRa);E.Z.N.A.?質粒小量提取試劑盒 化.Z.N.A.TMpiasmid Mini Kitl,Omega)、膠回收試劑盒（BioSpin Gel Extraction Kit, Bioflux);哺乳動物細胞轉染試劑(；Lipofectamine?2000,Invit;rogen)、巧光素酶檢測試劑 盒(Luciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer ,Promega)、蛋白質濃度巧|]定 試劑盒（Pierce狡 BCAProteinAssay Kit ,Thermo)、G418(Amresco)、二甲亞諷化MSO, Si卵a)、 鹽酸克倫特羅(CLE，Sigma)、細胞培養皿(Thermo)、各種規格培養板(Corning);其它化學試 劑除注明外，均為國產分析純。
[002引 1.4儀器PCR儀(S1000?Thermal 切cler，BI0-RAD)、電泳儀(DYY-虹型，北京六一儀 器廠）、凝膠成像分析系統（畑emiDoc XRS+型，BI0-RAD)、超微量分光光度計（Nanodrop 2000，化6細0 Scient if ic)、顯微鏡（DMIL，Leica)、倒置相差巧光顯微鏡（DMI4000B, LeiCa)、C02培養箱(MAC0-15AC，SANYO)、超凈工作臺（SW-CJ-2N型，哈爾濱東聯公司）、酶標 儀（Varioskan.貨Flash, Thermo Scientific)。
[0029] 實施例1重組質粒的構建 1.1試驗方法 W大鼠基因組DNA為模板，設計引物在rNGF啟動子序列的上下游分別引入MluI和Afin 酶切位點PCR擴增得到啟動子片段JNGFpro(縮寫為化）（-615bp~巧化p)(+l為基因轉錄起 始位點），正向引物序列見SEQ NO. 2，反向引物序列見SEQ NO. 3。1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定， 乙醇沉淀回收得到各啟動子片段。分別雙酶切載體PSC-E2及各啟動子片段(化），1 %瓊脂糖 凝膠電泳，膠回收目的片段，連接載體與啟動子片段，轉化大腸桿菌，氨節青霉素平板抗性 篩選，挑選陽性轉化子，進行快速裂解鑒定，陽性者擴大培養后提取質粒，進行酶切和PCR鑒 定，對鑒定成功的質粒進行測序，最后獲得重組質粒P化-E2。
[0030] 同理制備獲得重組質粒P化-Luc。
[0031] 1.2實驗結果 如圖I的示意圖所