一種高效快速抑制結縷草內源基因表達的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種農桿菌介導的病毒誘導基因沉默技術用于高效快速抑制結縷草 內源基因表達的方法，屬于基因工程和生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 結縷草(Zoysia japonicaL.)是禾本科畫眉草亞科結縷草屬的多年生植物，是世 界公認的優良暖季型草坪草，具有廣泛的±壤適應性、較強的抗性(抗寒性、抗旱性、耐鹽 性、抗病蟲害等)和耐粗放管理、省水節肥等優良特性，被廣泛用于暖溫帶和亞熱帶的公園 綠化、高爾夫球場和體育場等各種草坪的建設，在草坪產業中具有十分重要的地位。
[0003] 對結縷草抗逆、發育相關重要基因進行功能研究能夠為基因工程育種和分子輔助 育種提供重要的候選基因和理論依據。然而目前所建立的農桿菌介導的結縷草遺傳轉化方 法步驟繁瑣且效率低下，嚴重阻礙了在結縷草植物體內進行目的基因功能的驗證。病毒誘 導的基因沉默技術利用病毒感染植物后植物對病毒RNA序列進行特異性識別和降解的機 審Ij，將目標基因序列融入病毒序列中，使感染重組病毒的植物體內病毒RNA和目標基因mRNA 序列均被識別和降解，是一種高效抑制基因表達的技術方法。截至目前，已有多個病毒誘導 基因沉默載體得到構建，成功用于水稻、二穗短柄草、高梁等禾本科植物的基因沉默實驗， 然而遺憾的是仍未有結縷草病毒誘導基因沉默技術的報道。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種高效快速抑制結縷草內源基因表達的方法，通過如下 技術方案實現。
[0005] (1)結縷草目的基因片段的克隆。
[0006] 在已知結縷草目的基因序列情況下，設計PCR擴增目的基因片段的上下游引物，設 計原則保證PCR擴增產物長度大于lOObp，同時在上下游引物5'端分別添加限制性內切酶 Mlu巧日化Cl的識別堿基序列ACGCGT和TTAATTAA。提取結縷草RNA，逆轉錄成CDNA，使用高保 真酶PCR擴增獲得目的基因片段。電泳、切膠回收預期大小的PCR產物，連接平末端PCR產物 克隆載體，轉化大腸桿菌D冊a，涂布抗性平板，挑取克隆，用載體自帶引物PCR鑒定獲得陽性 克隆后，測序確認PCR產物的正確性。
[0007] 在結縷草目的基因序列未知情況下，可W根據目的基因在其它物種的同源基因序 列設計簡并引物先從結縷草CDNA中PCR擴增獲得部分基因序列，測序確認序列正確性后遵 照上述方法獲得目的基因片段。
[000引（2)病毒誘導基因沉默載體的構建。
[0009]提取上述測序驗證的含有結縷草目的基因片段的PCR產物克隆載體質粒和水稻東 格魯桿狀病毒基因沉默載體pRTBV-MVIGS質粒，使用MluI和化Cl兩個限制性內切酶于37°C 酶切8小時；電泳、切膠回收目的基因和pRTBV-MVIGS載體酶切片段，使用T4 DNA連接酶將摩 爾比為3:1的目的基因和pRTBV-MVIGS載體酶切回收片段進行連接，連接條件為16°C8小時； 將連接產物轉化大腸桿菌D冊a，涂布卡那霉素抗性平板，挑取克隆，使用載體酶切位點兩側 序列設計的引物RTBV-F(序列：GGATCCGGGCCCTTAATTA)和RTBV-R(序列： AGGCTGGAGGCATAAACGC)進行菌落PCR，對克隆進行鑒定。
[0010] (3)農桿菌浸染結縷草植株。
[0011] 將連接結縷草目的基因片段的pRTBV-MVIGS質粒轉化農桿菌EHA105,涂布卡那霉 素和利福平雙重抗性平板，挑取克隆，使用RTBV-F和RTBV-R引物進行菌落PCR檢測。將PCR鑒 定陽性克隆按1:100比例擴大培養于含卡那霉素和利福平的LB培養基，28°C培養過夜至 ODsoq約為3。將培養液倒入離屯、管，4000 g、4°C離屯、10分鐘收集菌體。用浸染緩沖液（10 mM 嗎口林乙橫酸，10 mM氯化儀，7.5 ml氯化巧，300 ml乙酷下香酬，pH 5.6)重懸菌體，使ODsoo達 到l.5,倒入燒杯中，室溫靜置3小時。將光照16小時/黑暗8小時、28°C條件下培養7天的結縷 草幼苗從化agland培養基中取出，用清水洗去培養基，轉移至含有農桿菌浸染液的燒杯中， 用濾網蓋住結縷草幼苗使其浸沒于液面下。將燒杯放入連有真空累的真空室中，抽真空5分 鐘后，將幼苗取出，用清水洗去粘附的浸染液，重新轉移至化agland培養基中，于光照16小 時/黑暗8小時、28°C條件繼續培養21天。將含農桿菌的浸染廢液用高溫蒸汽滅菌后再予W 丟棄。
[0012] (4)基因表達豐度的分子檢測。
[0013] 將未浸染的培養28天的結縷草植株W及浸染后繼續培養21天的結縷草植株從 化agland培養基中取出，剪下其葉片，提取其RNA，逆轉錄成cDNA。設計檢測目的基因表達的 PCR引物，避開第（1)步中PCR擴增目的基因區段，使用實時定量PCR獲得目的基因在對照植 株和浸染病變植株的Ct值。同時使用結縷草內參基因肌動蛋白（actin)的檢測引物對內參 基因actin在對照植株和浸染病變植株的表達量進行分析，獲得響應的Ct值，用2 AAU算法 計算獲得目的基因在對照植株和浸染病變植株中相比actin基因的相對表達量。
[0014] 本發明的技術優勢及有益效果在于。
[0015] (1)相比耗時長且步驟繁瑣的農桿菌介導的愈傷組織轉化方法，本發明所提供的 方法能夠在4周內高效的將結縷草內源基因的表達進行抑制，通過觀察基因表達被抑制植 株相比對照植株的表型，可W快速地分析基因的功能。
[0016] (2)相比已報道的農桿菌介導的病毒誘導基因沉默方法，本發明所提供的方法使 用真空累輔助農桿菌浸染結縷草葉片，相比注射器直接注射葉片提高了農桿菌浸染效率。 在浸染液配方中，本發明提供的方法新加入了7.5 mM的氯化巧，也極大的提高了浸染效率。
[0017] (3)與結縷草CDNA文庫相結合，使用本發明所提供的方法可W快速高通量地篩選 與抗逆、生長發育相關的未知結縷草基因，為分子標記輔助育種和基因工程育種提供大量 的候選基因。
【附圖說明】
[0018] 圖1為結縷草兩個品種八氨番茄紅素脫氨酶基因表達被抑制的表型照片。
[0019] 圖2為結縷草兩個品種八氨番茄紅素脫氨酶基因表達被抑制的定量PCR檢測結果。
【具體實施方式】
[0020] 下述實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方 法，如無特殊說明，均為常規方法。實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生 化試劑商店購買得到。實施例中的定量實驗，均設置=次重復實驗，結果取平均值。
[0021] 實施例1結縷草八氨番茄紅素脫氨酶基因沉默導致植株葉片白化。
[0022] 國審結縷草品種'蘭引3號'結縷草和美國進口品種'Crowne'結縷草:江蘇省中國 科學院植物研究所草業研究中屯、。pRTBV-MVIGS質粒：印度德里大學南方校區植物分子生物 學系（參考文獻：Purkayastha A, Mathur S, Verma V, Sharma S, Dasgupta I. Virus-induced gene silencing in rice using a vector derived from a DNA virus. Planta, 2010，232: 1531-1540)。大腸桿菌D冊a和農桿菌EHA105:江蘇省中國科學院植物 研究所草業研究中屯、。
[0023] 一、結縷草八氨番茄紅素脫氨酶基因（phytoene desaturase,PDS)的克隆。
[0024] 使用天根生化科技(北京）有限公司的RNAprep植物總RNA提取試劑盒提取'蘭引3 號'結縷草葉片的總RNA，操作步驟按試劑盒自帶說明書進行。使用寶生物(大連)有限公司 的逆轉錄試劑盒將結縷草總RNA逆轉錄為cDNA，操作步驟按試劑盒自帶說明書進行。
[0025] 根據NCBI已登錄的植物PDS基因的核巧酸序列設計擴增結縷草PDS基因的簡并引 物PDS-F-290/PDS-R-980，如表1所示，PCR擴增獲得結縷草PDS基因中間區段。電泳，切膠回 收PCR產物，連接全式金(北京)生物技術有限公司的祀ASY-Blunt Simple載體，得到連接產 物，轉入大腸桿菌D冊a中，抗性篩選挑取陽性克隆，將陽性克隆進行液體培養，提取陽性克 隆質粒進行測序。 「nn)Al 與巨1 呂I味如方||與巨
[0027]采用RACE PCR的方法獲取結縷草全長PDS基因序列，具體步驟如下： 1、根據測序獲得的結縷草PDS基因的中間區段核巧酸序列設計擴增結縷草PDS基因全 長的巢式PO?引物5 ' -PDS-1/5 ' -PDS-2和3 ' -PDS-1/3 ' -PDS-2 W及接頭引物曰(1曰口1〇'-〇11邑〇肌、日(1日91:〇1-1和日(1日91:〇1-2，如表1所示； 2、 3'RACE使用接頭引物adaptor-oligodT進行擬轉錄，使用寶生物（大連)有限公司的 逆轉錄試劑盒按試劑盒自帶說明書進行。5'RACE先使用基因特異性引物5'-PDS-l進行逆轉 錄，反應條件同上，接下來加入化L 10 X buffer ,IyL dATP和IyL末端脫氧核巧酸轉