雄性不育突變體oss125及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物生物技術領域，具體涉及植物雜交育種方法，包括不育系繁殖和 雜交種子制備，更具體地涉及一個雄性不育突變體及其在雜交育種中的應用。 技術背景
[0002] 水稻是我國重要的糧食作物。從上世紀80年代起，W雄性不育為基礎的雜交水稻 育種技術極大的提高了水稻的單產，在保障我國糧食安全中發揮關鍵性作用。雜交水稻制 種是用恢復系作父本和不育系雜交生產雜交種子的過程。利用作物雜種優勢是提高作物產 量的重要途徑，而作物雄性不育是有效利用雜種優勢的前提和基礎。水稻育性是影響水稻 產量的關鍵因素，為了提高產量和獲取雜種優勢，在雜交育種過程中，對雄性不育和雄性可 育的遺傳操作是一個關鍵步驟。利用雄性不育系生產雜交種，不僅能節省大量去雄的人工， 降低種子成本，而且可W減少因去雄不凈所造成的混雜，從而提高種子純度，充分發揮雜種 優勢的作用。水稻雄性不育的發現與利用為增加水稻產量，改進品質，增加抗性和適應性提 供優異種源，因而在植物育種上具有重要的應用價值。
[0003] 植物雄性不育是指在有性繁殖過程中不能產生正常可育雄配子體的遺傳現象，在 廣泛的開花植物中普遍存在。水稻作為模式植物，雄性生殖發育的顯著特征是形成6枚雄 蕊，任何參與雄蕊發育、抱原細胞分化、減數分裂、小抱子的有絲分裂、花粉分化或開花等過 程基因的突變，均有可能引起花藥發育異常，最終導致雄性不育（Ma H. Molecular genetic analysis of microsporogenesis and microgametogenesis in flowering plants. Annual Review of Plant Biology. 2005, 56:393-434.)〇
[0004] 雄性不育可W分為細胞質雄性不育(^cytoplasmic male sterility, CM巧和細胞 核雄性不育（genic male sterility, GM巧。細胞質雄性不育的實質是細胞質基因組與細 胞核基因組競爭傳遞自身遺傳物質的結果。細胞核雄性不育由核基因突變產生，突變性狀 可通過雌配子或者雄配子遺傳。遺傳分析表明，大多數雄性育性是由核基因控制的（Sunok M, Ki-Hong J, Do-Eun L, Dong-Yeon L, Jinwon L, Kyungsook An, Hong-Gyu K, Gynheung An. The rice FONlgene controls vegetative and reproductive development by regulating shoot apical meristem size. Molecules and Cells.2006, 21(I):147-152)。
[0005] 近年來，隨著水稻基因組測序的完成，水稻突變體庫的構建W及基因表達譜分析 等工作的開展，水稻花粉發育的分子機理研究起取得了一定的進展，發現了一些控制水稻 花器官數目基因，如FONl~4^、0sL服1，控制花粉囊細胞的分開和分化基因MSPUOsTDLlA， 控制雄性減數分裂基因PAIRl、PAIR2、PAIR3、MELl、MILl、DTMl、0sSG01等，促進花粉粒發育 的關鍵基因CYP703A3、CYP704B2、WDA1、OsNOP、DPW、U甜2、MTRl等。送些基因涉及多個方 面，包括小抱子母細胞的減數分裂、絨租層發育及降解，W及花粉細胞壁形成等方面。根據 不育基因的功能和調控時期的差異，可將水稻隱性核雄性不育基因主要分為3類；1)小抱 子母細胞發育時期不育基因；2)絨租層發育時期不育基因；3)花粉囊和花粉外壁發育時期 不育基因。
[0006] 目前水稻突變體基因克隆最常用的技術有圖位克隆、同源克隆、轉座子或T-DNA 標記法、表達序列標簽法、差異表達基因克隆等技術。隨著高通量測序技術的發展，2012 年，日本科學家提出了基于重測序方法的Mutmap基因克隆技術（Abe A, Kosugi S,化shida K,Natsume S,Takagi H, Kan-zaki H, Matsumura H, Yoshida K,Mistsuoka C, Muluneh T,Innan H, Cano L, Kamoun S,Teraushi R.Genome sequencing reveals agronomicalIy important loci in rice using MutMap. Nature Biotechnology. 2012, 30(2):174-178)， 該技術將突變體與野生型親本進行雜交，產生Fz代分離群體，隨機取20-30個突變個體，分 別提取基因組DNA，等量混合后，利用二代測序技術，結合分子生物學與生物信息學分析測 序數據，找出候選突變基因，大大縮短了基因克隆時間，降低了基因克隆成本。
[0007] 到目前為止，涉及水稻花藥發育和花粉形成的一些關鍵基因已被鑒定和研究，送 些基因的突變導致雄性不育的表型。但對水稻雄配子體發育過程和調控機制并未完全探 明，水稻雄性不育基因的定位與克隆有助于更全面地了解雄配子體發育的分子機制，加快 利用雄性不育株系進行育種的進程。
[0008] 本研究通過EMS誘變水稻品種黃華占，篩選得到一個由單個隱性核基因控制的雄 性不育突變體，命名為OSS125,對其進行初步的表型鑒定、遺傳分析及遺傳背景鑒定，并利 用改進的MutMap方法（陳竹鋒，嚴維，王娜，張文輝，謝剛，盧嘉威，簡智華，劉東風， 唐曉艷.利用改進的MutMap方法克隆水稻雄性不育基因.遺傳 .2014, 36(1) :85-93)，結 合HRM及基因序列分析，成功定位并克隆了該雄性不育基因。本發明還闡述了所述雄性不 育基因的應用范圍和應用方法。
【發明內容】
[0009] 本文提到的所有參考文獻都通過引用并入本文。
[0010] 除非有相反指明，本文所用的所有技術和科學術語都具有與本發明所屬領域普通 技術人員通常所理解的相同的含義。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技術是本領 域普通技術人員公知的標準技術。材料、方法和例子僅作闡述用，而非加W限制。
[0011] 本發明包括一種育性相關基因及其核巧酸和蛋白序列，還包括通過操作該基因在 調控植株雄性生育力中的應用。非限制性地舉例而言，下文描述的任何方法都可與本發明 所提供的相應核巧酸序列一起使用，例如，將所述育性基因的突變體序列引入植株W導致 植株雄性不育、使植株內源序列突變、向植株中引入該序列的反義序列、使用發卡形式、或 將其與其它核巧酸序列連接起來調控植株的表型，或者是本領域技術人員已知的可用于影 響植株的雄性生育力的多種方法中的任一方法。
[0012] 本發明利用改進的Mutmap方法克隆得到了一個雄性不育突變基因（0sS125)， 該基因與0sRPAla(L0C_0s02g53680)是等位基因。OsRPAla是一個復制蛋白 A巧巧Iication protein A，RPA)，是真核生物中高度保守的單鏈DNA結合蛋白，由H個亞 基 RPAl, RPA2 和 RPA3 組成的一個穩定的復合體（Wold M S. Replication protein A:a heterotrimeric, single-str曰nded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA met油olism. Annual Review of Biochemistry. 1997, 66:61-92)。在酵母和人中，RPA為DNA 代謝的多個過程所必需，如DM復制，DM修復W及同源重組等。大部分真核生物包括真菌、 昆蟲和脊椎動物等編碼RPA各亞基的RPA基因都只有一個，而在擬南芥和水稻中含有多個 RPA基因。水稻中含有3個RPA的旁系同源基因，包括RPAl，RPA2和RPA3。前人研究已經 在體內和體外證明它們在生化水平上可W互作，但它們確切的功能并不清楚。通過T-DNA 插入突變體研究發現，OS巧ala突變體在營養生長期中表型正常但在生殖生長期中不育。細 胞學分析表明該突變體雌性母細胞中沒有形成胚囊，同時雄性母細胞在減數分裂后期I出 現異常的染色體片段，植株表現為雄性半不育和雌性完全不育。該結果說明OsRPAla在水 稻雄配子和雌配子發育過程中都起著重要作用，由于T-DNA插入對OsRPAla蛋白功能有不 同層度的影響，說明OsRPAla蛋白可能有兩個功能區，分別控制雄性和雌性發育。本發明中 獲得的OSS125突變體的不育性狀是由于OsRPAla基因外顯子上有一個氨基酸的置換，該突 變可能僅影響了 OsRPAla蛋白對雄性器官發育調控，而對雌性器官發育沒有明顯影響，提 示該基因在雄性器官和雌性器官中發揮作用的方式或位點