一種枯草芽孢桿菌發酵生產啟動子及其應用方法
一種枯草芽孢桿菌發酵生產啟動子及其應用方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物基因工程領域，具體設及一種枯草芽抱桿菌發酵生產啟動子及 其應用方法。
【背景技術】
[0002] 啟動子為RNA聚合酶特異性識別和結合的DNA序列。啟動子是基因（gene)的一個組 成部分，控制基因表達(轉錄）的起始時間和表達的程度。啟動子(Promoters)就像"開關"， 決定基因的活動。既然基因是成序列的核巧酸(nucleotides )，那么啟動子也應由核巧酸組 成。啟動子本身并不控制基因活動，而是通過與稱為轉錄(transcription)因子的運種蛋白 質（proteins)結合而控制基因活動的。轉錄因子就像一面"旗子"，指揮著酶(enzymes )(RNA 聚合酶polymerases)的活動。運種酶指導著RNA復制。
[0003] 啟動子位于結構基因5'端上游的一段DNA序列，能夠指導全酶化oloenzyme)同模 板正確結合，活化RNA聚合酶，啟動基因轉錄。全酶是指酶蛋白及其輔酶構成的有功能的復 合物。
[0004] 隨著生物工程技術的發展，越來越多的微生物發酵的方法應用于化學品、酶蛋白 W及藥劑的生產。其中，枯草芽抱桿菌由于其安全無毒、遺傳背景清晰、分泌表達水平高等 諸多優點，而成為工業用理想的宿主細胞。枯草芽抱桿菌中表達異源蛋白需要各種元件，其 中，啟動子對于表達水平的影響至關重要。目前成功用于枯草芽抱桿菌表達平臺的啟動子 主要有?43、口曰11179、口3口曰(3、口巧14等，運些啟動子在實驗室的富集培養基中表現良好，但鮮見 它們被用于酶蛋白的工業放大生產。因此，有必要找到更高效的、適合于工業培養基生產表 達的啟動子，W適應發酵對表達水平越來越高的要求。
[0005] 綠色巧光蛋白基因gfp可W作為啟動子的一個報告基因，構建于啟動子的下游，綠 色巧光蛋白GFP的有無，表征啟動子的作用；綠色巧光蛋白GFP的亮度，即綠色巧光蛋白GFP 的產量，在同等條件下表征啟動子的強弱。在啟動子篩選或啟動子功能比較中，可W用GFP 的表達水平作為鑒定的標準。
【發明內容】
[0006] 為了克服現有技術中所存在的問題，本發明的目的在于提供一種枯草芽抱桿菌發 酵生產啟動子及其應用方法。
[0007] 為了實現上述目的W及其他相關目的，本發明采用如下技術方案：
[000引本發明的第一方面提供了一種分離的多核巧酸，所述多核巧酸的堿基序列含有如 沈Q ID NO. 1所示序列。
[0009] 優選地，所述分離的多核巧酸序列的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示，具體為：
[0010] Ctctcactaaatagcaagtcatatctgtccgtccttccttttttccgccaagtgctgtttcagctgcattctcgccc tgtacagggtgctcttcaccttcgaaagactccagtccaaaacatcagcaatctcttcgtaagacagctcttgaaat atctgtcgaaatgctgaataaaatgactgaaaatctctgacatctgaaacaatccttttcgtttattaaggcctcac ccgtttagacaaacggctataaaaaaagttttacaaatcggaacatttttcccctatcatttttcccgacttcattt gtcatttttttcagaataaatcgcatcattcgactcatgtctgattcaacacgtgcctctcggcttataccccgatg ctggccgccgg過過gcctttccggg過Cg過ttct過tc過過ttc過tc過gcgg過gtct過gtttt過t過ttgc過g過過tg過g過g過 atgctggtttattataacaatataagttttcattattttcaaaaagggggatttatto
[0011] 本發明的第二方面提供了前述分離的多核巧酸作為啟動子的用途，所述啟動子用 于多種蛋白或多膚的表達。
[0012] 優選地，所述啟動子用于微生物反應器中多種蛋白或多膚的表達。
[0013] 具體的，所述微生物反應器可W為微生物宿主細胞。
[0014] 更具體的，所述啟動子可用于在微生物宿主細胞中指導多種不同來源的蛋白或多 膚的誘導表達。
[0015] 優選地，所述微生物宿主細胞包括但不限于枯草芽抱桿菌。
[0016] 進一步的，所述的多種不同來源的蛋白或多膚可W是任意分子量的蛋白質，如酶 蛋白、各種植物來源蛋白、各種動物或細菌來源蛋白，W及抗體等。
[0017] 本發明的第=方面提供了一種啟動子，所述啟動子的堿基序列中含有如SEQ ID NO. 1所示的分離的多核巧酸序列。
[0018] 優選地，所述啟動子的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0019] 本發明的第四方面提供了所述啟動子用于構建或改造表達載體的用途。
[0020] 優選地，所述啟動子用于構建或改造微生物反應器表達載體。
[0021] 進一步優選地，所述的啟動子可作為指導外源蛋白表達的元件用于構建或改造微 生物反應器表達載體。
[0022] 所述待改造微生物生物反應器表達載體包括但不限于枯草芽抱桿菌表達載體。所 述枯草芽抱桿菌表達載體包括但不限于pM4系列載體等。
[0023] 本發明的第五方面提供了一種表達載體，所述表達載體含有至少一個所述的啟動 子，由所述的啟動子來指導外源蛋白的表達。具體如綠色巧光蛋白GFP。
[0024] 優選地，所述表達載體為將現有表達載體中的啟動子替換為本發明的前述啟動 子，或者在現有表達載體中添加本發明的前述啟動子后獲得。
[0025] 本發明的一優選實施例中，在現有表達載體pMK4中添加了本發明所述的啟動子后 獲得了新的表達載體。
[0026] 更優選地，所述表達載體上的啟動子的下游連接有GFP基因。
[0027] 本發明的第六方面提供一種宿主細胞，所述細胞含有前述表達載體或基因組中整 合有外源的所述啟動子。
[0028] 本發明的第屯方面提供了一種蛋白或多膚的表達方法，包括下列步驟：
[0029] 1)采用前述表達載體構建所述多種不同來源的蛋白或多膚的重組表達載體；
[0030] 2)將步驟1)獲得的重組表達載體轉染宿主，并在合適表達所述蛋白或多膚的條件 下培養所述宿主。
[0031] 優選地，所述宿主可W為宿主細胞，在本發明一實施例中，所述宿主為枯草芽抱桿 園。
[0032] 優選地，所述在合適表達所述蛋白或多版的條件下具體為采用工業生產培養基 PPB誘導。
[0033] 優選的，所述步驟2)后，可從培養物中分離出所述蛋白或多膚，或者通過檢測儀器 檢測所述多種不同來源的蛋白或多膚。在本發明一實施例中，所述蛋白或多膚為GFP。
[0034] 通過常規的重組DNA技術即可構建所述多種不同來源的蛋白質或多膚的重組表達 載體，例如將目的基因片段插入所述表達載體的多克隆位點，并置于本發明所述啟動子的 控制之下。所述目的基因片段應當至少包含多種不同來源的蛋白質或多膚的基因的完整編 碼區。
[0035] 獲得的轉有重組表達載體的宿主細胞可W用常規方法培養，表達外源蛋白質或多 膚。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自已知的各種合適的培養基或培養液， 在適于宿主細胞生長的條件下進行培養并表達外源蛋白質或多膚。如果需要，可利用其物 理的、化學的和其它特性或添加純化標簽通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。運些 方法是本領域技術人員所熟知的。運些方法的例子包括但并不限于：用蛋白沉淀劑處理(鹽 析方法）、離屯、、滲透破壁、超處理、超離屯、、分子篩層析(凝膠過濾）、吸附層析、離子交換層 析、高效液相層析化PLC)和其它各種液相層析技術及運些方法的結合。
[0036] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
[0037] 本發明的發明人，將前述啟動子與GFP連接，轉化枯草芽抱桿菌，檢測啟動子對外 源基因（或蛋白）表達的影響。通過檢測GFP的表達結果證明，該啟動子具有啟動子的活性， 并受工業生產培養基PPB誘導活性增強。此外，本發明啟動子與其他啟動子進行比較，所誘 導表達的GFP量比其他啟動子高65%~114%，外源蛋白或多膚在微生物的重組生產，并具 有受誘導可調控的活性特征。
【附圖說明】
[0038] 圖1是克隆了啟動子P1398的表達質粒pMK4-P1398-g巧圖。
[0039] 圖 2 是質粒pMK4-奸P、PMK4-P1398-gf P、PMK4-P43-奸P、pMK4-Pxy 1 A-gf P 的構建流 程圖。
[0040] 圖 3 是克隆了 啟動子P1398、P43、PxyiA 的表達質粒pMK4-P1398-gfp、pMK4-P43-奸P、 pMK4-PxylA-gfp在枯草芽抱桿菌中，在蛋白酶生產培養基培養條件下發酵后表達的巧光量 圖。
【具體實施方式】
[0041] 在進一步描述本發明【具體實施方式】之前，應理解，本發明的保護范圍不局限于下 述特定的具體實施方案;還應當理解，本發明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發明的保護范圍。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法， 通常按照常規條件，或者按照各制造商所建議的條件。
[0042] 當實施例給出數值范圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值范圍的兩個端 點W及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本發明中使用的所有技術和 科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、 材料外，根據本技術領域的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可W使用與本 發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實 現本發明。
[0043] 除非另外說明，本發明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術領 域常規的分子生物學、生物化學、染色質結構和分析、分析化學、細胞培養、重組DNA技術及 相關領域的常規技術。運些技術在現有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook等 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor LaboratoiT Press,1989 and Third edition，2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BI0L0GY，John Wiley&Sons,New York,1987 and periodic updates;the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTIONJMrd edition ,Academic Press, San Diego ,1998 !METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，畑romatin。.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.),Academic Press，San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY'Vol.119,Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press,Totowa，1999等。
[0044] 實施例1構建質粒PMK4-P1398-奸p、pMK4-P43-奸p、pMK4-P巧lA-gfp并在枯草芽抱 桿菌中表達綠色巧光蛋白GFP
[0045] 1. DNA片段的擴增
[0046] W2409-PstF(沈Q ID N0.2)和2409NdeR(SEQ ID ^.3)為引物，^1398基因組為 模板，擴增P1398;WP43-PstF(SEQ ID N0.4)和P43-XmaR(沈Q ID ^.5)引物，^9]\
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物基因工程領域，具體設及一種枯草芽抱桿菌發酵生產啟動子及 其應用方法。
【背景技術】
[0002] 啟動子為RNA聚合酶特異性識別和結合的DNA序列。啟動子是基因（gene)的一個組 成部分，控制基因表達(轉錄）的起始時間和表達的程度。啟動子(Promoters)就像"開關"， 決定基因的活動。既然基因是成序列的核巧酸(nucleotides )，那么啟動子也應由核巧酸組 成。啟動子本身并不控制基因活動，而是通過與稱為轉錄(transcription)因子的運種蛋白 質（proteins)結合而控制基因活動的。轉錄因子就像一面"旗子"，指揮著酶(enzymes )(RNA 聚合酶polymerases)的活動。運種酶指導著RNA復制。
[0003] 啟動子位于結構基因5'端上游的一段DNA序列，能夠指導全酶化oloenzyme)同模 板正確結合，活化RNA聚合酶，啟動基因轉錄。全酶是指酶蛋白及其輔酶構成的有功能的復 合物。
[0004] 隨著生物工程技術的發展，越來越多的微生物發酵的方法應用于化學品、酶蛋白 W及藥劑的生產。其中，枯草芽抱桿菌由于其安全無毒、遺傳背景清晰、分泌表達水平高等 諸多優點，而成為工業用理想的宿主細胞。枯草芽抱桿菌中表達異源蛋白需要各種元件，其 中，啟動子對于表達水平的影響至關重要。目前成功用于枯草芽抱桿菌表達平臺的啟動子 主要有?43、口曰11179、口3口曰(3、口巧14等，運些啟動子在實驗室的富集培養基中表現良好，但鮮見 它們被用于酶蛋白的工業放大生產。因此，有必要找到更高效的、適合于工業培養基生產表 達的啟動子，W適應發酵對表達水平越來越高的要求。
[0005] 綠色巧光蛋白基因gfp可W作為啟動子的一個報告基因，構建于啟動子的下游，綠 色巧光蛋白GFP的有無，表征啟動子的作用；綠色巧光蛋白GFP的亮度，即綠色巧光蛋白GFP 的產量，在同等條件下表征啟動子的強弱。在啟動子篩選或啟動子功能比較中，可W用GFP 的表達水平作為鑒定的標準。
【發明內容】
[0006] 為了克服現有技術中所存在的問題，本發明的目的在于提供一種枯草芽抱桿菌發 酵生產啟動子及其應用方法。
[0007] 為了實現上述目的W及其他相關目的，本發明采用如下技術方案：
[000引本發明的第一方面提供了一種分離的多核巧酸，所述多核巧酸的堿基序列含有如 沈Q ID NO. 1所示序列。
[0009] 優選地，所述分離的多核巧酸序列的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示，具體為：
[0010] Ctctcactaaatagcaagtcatatctgtccgtccttccttttttccgccaagtgctgtttcagctgcattctcgccc tgtacagggtgctcttcaccttcgaaagactccagtccaaaacatcagcaatctcttcgtaagacagctcttgaaat atctgtcgaaatgctgaataaaatgactgaaaatctctgacatctgaaacaatccttttcgtttattaaggcctcac ccgtttagacaaacggctataaaaaaagttttacaaatcggaacatttttcccctatcatttttcccgacttcattt gtcatttttttcagaataaatcgcatcattcgactcatgtctgattcaacacgtgcctctcggcttataccccgatg ctggccgccgg過過gcctttccggg過Cg過ttct過tc過過ttc過tc過gcgg過gtct過gtttt過t過ttgc過g過過tg過g過g過 atgctggtttattataacaatataagttttcattattttcaaaaagggggatttatto
[0011] 本發明的第二方面提供了前述分離的多核巧酸作為啟動子的用途，所述啟動子用 于多種蛋白或多膚的表達。
[0012] 優選地，所述啟動子用于微生物反應器中多種蛋白或多膚的表達。
[0013] 具體的，所述微生物反應器可W為微生物宿主細胞。
[0014] 更具體的，所述啟動子可用于在微生物宿主細胞中指導多種不同來源的蛋白或多 膚的誘導表達。
[0015] 優選地，所述微生物宿主細胞包括但不限于枯草芽抱桿菌。
[0016] 進一步的，所述的多種不同來源的蛋白或多膚可W是任意分子量的蛋白質，如酶 蛋白、各種植物來源蛋白、各種動物或細菌來源蛋白，W及抗體等。
[0017] 本發明的第=方面提供了一種啟動子，所述啟動子的堿基序列中含有如SEQ ID NO. 1所示的分離的多核巧酸序列。
[0018] 優選地，所述啟動子的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0019] 本發明的第四方面提供了所述啟動子用于構建或改造表達載體的用途。
[0020] 優選地，所述啟動子用于構建或改造微生物反應器表達載體。
[0021] 進一步優選地，所述的啟動子可作為指導外源蛋白表達的元件用于構建或改造微 生物反應器表達載體。
[0022] 所述待改造微生物生物反應器表達載體包括但不限于枯草芽抱桿菌表達載體。所 述枯草芽抱桿菌表達載體包括但不限于pM4系列載體等。
[0023] 本發明的第五方面提供了一種表達載體，所述表達載體含有至少一個所述的啟動 子，由所述的啟動子來指導外源蛋白的表達。具體如綠色巧光蛋白GFP。
[0024] 優選地，所述表達載體為將現有表達載體中的啟動子替換為本發明的前述啟動 子，或者在現有表達載體中添加本發明的前述啟動子后獲得。
[0025] 本發明的一優選實施例中，在現有表達載體pMK4中添加了本發明所述的啟動子后 獲得了新的表達載體。
[0026] 更優選地，所述表達載體上的啟動子的下游連接有GFP基因。
[0027] 本發明的第六方面提供一種宿主細胞，所述細胞含有前述表達載體或基因組中整 合有外源的所述啟動子。
[0028] 本發明的第屯方面提供了一種蛋白或多膚的表達方法，包括下列步驟：
[0029] 1)采用前述表達載體構建所述多種不同來源的蛋白或多膚的重組表達載體；
[0030] 2)將步驟1)獲得的重組表達載體轉染宿主，并在合適表達所述蛋白或多膚的條件 下培養所述宿主。
[0031] 優選地，所述宿主可W為宿主細胞，在本發明一實施例中，所述宿主為枯草芽抱桿 園。
[0032] 優選地，所述在合適表達所述蛋白或多版的條件下具體為采用工業生產培養基 PPB誘導。
[0033] 優選的，所述步驟2)后，可從培養物中分離出所述蛋白或多膚，或者通過檢測儀器 檢測所述多種不同來源的蛋白或多膚。在本發明一實施例中，所述蛋白或多膚為GFP。
[0034] 通過常規的重組DNA技術即可構建所述多種不同來源的蛋白質或多膚的重組表達 載體，例如將目的基因片段插入所述表達載體的多克隆位點，并置于本發明所述啟動子的 控制之下。所述目的基因片段應當至少包含多種不同來源的蛋白質或多膚的基因的完整編 碼區。
[0035] 獲得的轉有重組表達載體的宿主細胞可W用常規方法培養，表達外源蛋白質或多 膚。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自已知的各種合適的培養基或培養液， 在適于宿主細胞生長的條件下進行培養并表達外源蛋白質或多膚。如果需要，可利用其物 理的、化學的和其它特性或添加純化標簽通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。運些 方法是本領域技術人員所熟知的。運些方法的例子包括但并不限于：用蛋白沉淀劑處理(鹽 析方法）、離屯、、滲透破壁、超處理、超離屯、、分子篩層析(凝膠過濾）、吸附層析、離子交換層 析、高效液相層析化PLC)和其它各種液相層析技術及運些方法的結合。
[0036] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
[0037] 本發明的發明人，將前述啟動子與GFP連接，轉化枯草芽抱桿菌，檢測啟動子對外 源基因（或蛋白）表達的影響。通過檢測GFP的表達結果證明，該啟動子具有啟動子的活性， 并受工業生產培養基PPB誘導活性增強。此外，本發明啟動子與其他啟動子進行比較，所誘 導表達的GFP量比其他啟動子高65%~114%，外源蛋白或多膚在微生物的重組生產，并具 有受誘導可調控的活性特征。
【附圖說明】
[0038] 圖1是克隆了啟動子P1398的表達質粒pMK4-P1398-g巧圖。
[0039] 圖 2 是質粒pMK4-奸P、PMK4-P1398-gf P、PMK4-P43-奸P、pMK4-Pxy 1 A-gf P 的構建流 程圖。
[0040] 圖 3 是克隆了 啟動子P1398、P43、PxyiA 的表達質粒pMK4-P1398-gfp、pMK4-P43-奸P、 pMK4-PxylA-gfp在枯草芽抱桿菌中，在蛋白酶生產培養基培養條件下發酵后表達的巧光量 圖。
【具體實施方式】
[0041] 在進一步描述本發明【具體實施方式】之前，應理解，本發明的保護范圍不局限于下 述特定的具體實施方案;還應當理解，本發明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發明的保護范圍。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法， 通常按照常規條件，或者按照各制造商所建議的條件。
[0042] 當實施例給出數值范圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值范圍的兩個端 點W及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本發明中使用的所有技術和 科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、 材料外，根據本技術領域的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可W使用與本 發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實 現本發明。
[0043] 除非另外說明，本發明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術領 域常規的分子生物學、生物化學、染色質結構和分析、分析化學、細胞培養、重組DNA技術及 相關領域的常規技術。運些技術在現有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook等 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor LaboratoiT Press,1989 and Third edition，2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BI0L0GY，John Wiley&Sons,New York,1987 and periodic updates;the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTIONJMrd edition ,Academic Press, San Diego ,1998 !METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，畑romatin。.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.),Academic Press，San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY'Vol.119,Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press,Totowa，1999等。
[0044] 實施例1構建質粒PMK4-P1398-奸p、pMK4-P43-奸p、pMK4-P巧lA-gfp并在枯草芽抱 桿菌中表達綠色巧光蛋白GFP
[0045] 1. DNA片段的擴增
[0046] W2409-PstF(沈Q ID N0.2)和2409NdeR(SEQ ID ^.3)為引物，^1398基因組為 模板，擴增P1398;WP43-PstF(SEQ ID N0.4)和P43-XmaR(沈Q ID ^.5)引物，^9]\
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0訪客 來自[中國] 2020年09月20日 06:10枯草桿菌在棉花種植上的應用
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