一種裸鼴鼠少突膠質前體細胞培養方法
【技術領域】
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[0001 ]本發明涉及細胞生物學技術領域，具體涉及一種細胞的分離純化及培養方法，特別涉及一種裸鼴鼠少突膠質前體細胞的分離純化和培養方法。
【背景技術】
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[0002]少突膠質細胞(Oligodendrocyte)是中樞神經系統的成髓鞘細胞，其包繞有髓神經元軸突形成的髓鞘結構對神經元有營養、支持和保護作用，并且髓鞘的存在是神經元軸突動作電位高效傳導的結構基礎，能夠保證神經元之間信息傳遞的速率。少突膠質細胞是由少突膠質前體細胞分化而來，在病理情況下，少突膠質前體細胞可以受到微環境的刺激而再次啟動分化。在中風、腦白質營養不良以及新生兒缺血缺氧性腦病等多種與腦缺血缺氧相關的疾病中一般會伴隨有髓鞘的損傷(Billiards SS1Haynes RL1Folkerth RD,Borenstein NSjTrachtenberg FL,Rowi tch DH,Ligon KL,Volpe JJ, KinneyHC.2008.Myelin abnormalities without oligodendrocyte loss in periventricularleukomalacia.Brain Pathol 18:153-163.)0
[0003]裸鼴鼠是一種變溫哺乳動物，在氧氣濃度僅有6%左右的不通風洞穴中能夠保持腦結構和功能的完整無損并進行正常的生命活動，尤其是耗氧量較高的少突膠質細胞。因此，研究裸鼴鼠少突膠質細胞特殊的低氧耐受能力對于腦缺血缺氧性疾病中少突膠質細胞損傷的治療具有重要的指導意義。由于在體微環境非常復雜，無法在體直接觀察少突膠質細胞在低氧環境中的功能改變情況及其適應機制，并且在體的結果可能容易受到微環境中其他細胞組分和結構的影響。因此需要建立離體的裸鼴鼠少突膠質細胞模型以彌補在體觀察的缺陷。
[0004]而少突膠質細胞是由少突膠質前體細胞分化而來，雖然前者增殖能力較差，但是少突膠質前體細胞具有較強的分裂增殖能力，易于體外培養，并通過誘導其分化的方法得到少突膠質細胞。目前，研究人員已經摸索出誘導小鼠神經干細胞球分化為少突膠質前體細胞并進一步使其分化為少突膠質細胞，以及大鼠少突膠質前體細胞的培養方法(WenjingYang，Lin Xiao,Cui Li,Xiuyun Liu,Mingdong Liu，Qi Shao,Dan Wang,Aijun Huang andCheng He.TIP30 inhibits oligodendrocyte precursor cell differentiat1n viacytoplasmic sequestrat1n of Oligl.Glia.2015 ;63(4): 684-98.)。另外，中國專利CN200910251053.X，申請公布號為CN101735983A，公開了一種大鼠的少突膠質前體細胞的分離純化方法，包括以下步驟:①獲取混合細胞，混合細胞培養基由DMEM/F12培養基和體積分數為10 %的胎牛血清組成;②培養混合細胞:混合神經細胞培養基由DMEM/F12培養基、體積分數為I %的N2添加劑和體積分數為15?20%的B104條件培養基組成;③消化分離少突膠質前體細胞;④純化少突膠質前體細胞:少突膠質前體細胞純化培養基由無糖DMEM培養基、濃度為5?lOmmol/L的乳酸、體積分數為1%的N2添加劑和體積分數為15?20%的B104條件培養基組成。
[0005]但是現有技術中無論小鼠還是大鼠的少突膠質前體細胞分離純化和培養方法均不適用于裸鼴鼠，目前國內外文獻尚無有關裸鼴鼠少突膠質前體細胞分離純化和培養方法的相關報道。
【發明內容】
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[0006]本發明的目的在于提供一種裸鼴鼠少突膠質前體細胞的分離純化和培養方法，以方便、高效的獲得純度高、狀態好的裸鼴鼠少突膠質前體細胞，為體外建立裸鼴鼠少突膠質前體細胞提供技術支持，同時為體外研究裸鼴鼠少突膠質前體細胞的分化、迀移以及低氧耐受能力、以及裸鼴鼠少突膠質細胞低氧耐受機制的闡述和相應治療藥物或靶分子的篩選提供強大的保障。
[0007]我們試用了目前小鼠、大鼠的少突膠質前體細胞分離純化和培養方法，結果發現均無法培養獲得純度高、狀態好的裸鼴鼠少突膠質前體細胞，而且裸鼴鼠少突膠質前體細胞增殖的數量也較少。
[0008]關于裸鼴鼠少突膠質前體細胞的培養尚沒有建立出可行的實驗方法，我們分析其原因，主要是:I)裸鼴鼠是一種變溫動物，其體細胞離體培養的溫度有待摸索，并且其不恒定的機體代謝速率導致其體細胞體外培養基區別于普通的大鼠或小鼠；2)裸鼴鼠生存在較為陰暗潮濕的環境中，其體細胞的培養對濕度有較高的要求;3)裸鼴鼠已經適應了外界低氧的環境，所以其體細胞離體培養環境中的氧氣濃度區別于常氧環境中生活的動物，并且需要摸索。
[0009]因此，裸鼴鼠少突膠質前體細胞的培養中最重要的摸索到合適的溫度、濕度和氧氣濃度，以及摸索到適合的培養基。
[0010]為達到此目的，本發明的裸鼴鼠少突膠質前體細胞的分離純化方法包括以下步驟:
[0011 ] A、收集裸鼴鼠大腦皮層混合膠質細胞:
[0012]分離出生1-7天裸鼴鼠大腦皮層組織，將組織剪碎，加入消化液混勻之后，將其放入三氣培養箱中消化；用混合神經細胞培養基終止消化，離心去除上清之后，在混合神經細胞培養基中將細胞沉淀重懸并吹打成單細胞懸液;將單細胞懸液種于包被有左旋多聚賴氨酸的培養瓶中；
[0013]所述的組織消化液，可以為常規的蛋白水解酶類消化液，例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等，輔以DNA酶以解除DNA片段粘連所致的細胞聚集。
[0014]優選的消化液:質量濃度為0.125%的胰酶和/或終濃度為0.2mg/ml的DNA酶。
[0015]所述的混合神經細胞培養基，可以為常規的含血清混合神經細胞培養液，例如低糖DMEM等。優選的混合神經細胞培養基為含有15 %體積百分比胎牛血清的低糖DMEM。
[0016]B、裸鼴鼠大腦皮層混合膠質細胞的培養:
[0017]將步驟A得到的混合膠質細胞，用混合神經細胞培養基中培養于三氣培養箱中25-30天；自混合膠質細胞接種之后，每7天采取半量換液的方法更換膠質細胞混合培養基;
[0018]所述的混合神經細胞培養基，可以為常規的混合神經細胞培養液，例如含體積分數15 %胎牛血清的低糖DMEM等。
[0019]C、裸鼴鼠少突膠質前體細胞的分離及純化培養:
[0020]將步驟B培養的混合神經細胞于恒溫震蕩搖床培養，恒溫35± 2°C，將震蕩培養的細胞懸液置于未包被有左旋多聚賴氨酸的培養皿中使細胞貼壁，使極易貼壁及貼壁能力強的其他膠質細胞貼于平皿底部，而少突膠質前體細胞由于僅在有左旋多聚賴氨酸包被的平皿商貼壁能力較強而懸浮在液體中，因此小心吸取上清，并將上清中的細胞種于包被有左旋多聚賴氨酸的培養皿中；待其貼壁后，用添加促分裂增殖因子的少突膠質前體細胞增殖培養基進行純化培養；
[0021]所述的增殖培養基為NeUr0basal/B27和促分裂增殖因子等，優選的增殖培養基為Neurobasal和B27以體積比為50:1的組合(添加體積百分數為2%B27的Neurobasal) ο
[0022]添加促分裂增殖因子指的是添加B104條件上清。
[0023]所述的三氣培養箱的參數設置為:溫度控制在35±2°C，氧濃度為5%，二氧化碳濃度為5±1%，濕度為96±2%。
[0024]進一步，步驟A中，取出生1-7天裸鼴鼠大腦，剝除腦膜后分離皮層組織，用顯微剪將組織剪碎至Imm3，加入消化液混勻之后，將其放入三氣培養箱中消化;消化條件為:胰酶濃度為0.125%，DNA酶濃度為0.2mg/ml，時間為30分鐘;然后用混合神經細胞培養基終止消化，離心去除上清之后，在混合神經細胞培養基中將細胞沉淀重懸并吹打成單細胞懸液;隨后將單細胞懸液種于包被有左旋多聚賴氨酸的T25培養瓶中。
[0025]進一步，步驟A中，所述左旋多聚賴氨酸濃度為0.01mg/ml。
[0026]進一步，步驟A中，所述離心參數設置為室溫下，SOOrpm，5分鐘。
[0027]進一步，步驟B中，用混合神經細胞培養基中培養于三氣培養箱中28天。
[0028]進一步，步驟C中，所述震蕩培養時間為20小時。
[0029]進一步，步驟C中，所述恒溫震蕩搖床轉速為200rpm。
[0030]進一步，步驟C中，恒溫震蕩培養過程中保持培養瓶口旋緊以減少瓶內外空氣交換。
[0031]進一步，步驟C中，所述細胞貼壁時間為I小時。
[0032]進一步，步驟C中，所述B104條件上清的收集是利用神經母細胞瘤B104細胞培養于二氣培養箱中，利用增殖培養基進行培養，待細胞生長至80 %融合度時，換為Neurobasal/B27培養基培養48小時，隨后收集上清并用0.22μπι濾器過濾后置于-70°C保存備用。
[0033]進一步，所述二氣培養箱參數設置為:37°C，21 %氧氣濃度，5 % 二氧化碳濃度，以及96%濕度。
[0034]進一步，所述少突膠質前體細胞增殖培養基為含有體積分數為30%B104條件上清的低糖DMEM。
[0035]本發明的有益效果在于:A、綜合使用多種培養基從裸鼴鼠新生鼠大腦皮層分離并純化培養少突膠質前體細胞，摸索出了適于變溫的嚙齒類哺乳動物裸鼴鼠少突膠質前體細胞的合理培養方法。我們發現5%氧濃度條件下，細胞狀態能夠得到較好的保持，并能夠保持增長;B、操作方法簡單，具有較高的可重復性。利用搖床將所需的少突膠質前體細胞按一定的轉速搖下，再進行第二次差速貼壁純化，不僅能夠得到純度為98%以上的少突膠質前體細胞，而且能夠最大程度的保持細胞活力和功能;C、通過使用少突膠質前體細胞增殖培養基，有效的保證了少突膠質前體細胞的增殖并保證純度能夠達到98%以上(針對少突膠質前體細胞特異性標記物NG2進行的免疫細胞化學染色結果)；④增殖培養基中無需額外添加生長因子，只需要利用B104細胞系的上清即可達到促進少突膠質前體細胞增殖的效果。
[0036]綜上所述，本發明方法能夠簡便、高效、經濟的獲得大量功能活性正常的裸鼴鼠少突膠質前體細胞，低氧條件下的培養能夠保證這種細胞在離體環境中依然能夠保持在體狀態下的生物學特性，從而便于直接在純凈的體外細胞培養模型中進一步研究裸鼴鼠少突膠質前體細胞的特殊生理功能，從而為探索其中的生物學機制并應用于臨床相關領域提供重要的理論依據。
【附圖說明】
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[0037]圖1為體外培養的混合神經細胞，其中A為40倍鏡下混合神經細胞，B為200倍鏡下混合神經細胞。
[0038]圖2為體外培養的少突膠質前體細胞(100倍光鏡)。
[0039]圖3為體外純化培養的少突膠質前體細胞免疫細胞化學染色鑒定，其中A為NG2，B為Hoechst，C為NG2/Hoechst ο
【具體實施方