一種小鼠唾液腺類器官體的體外培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于細胞工程領域，主要設及一種小鼠唾液腺類器官體的體外培養方法。
【背景技術】
[0002] 1唾液腺與唾液腺干細胞
[0003] 人和鼠的唾液腺主要由常見的=對腺體，腮腺、頌下腺和舌下腺，W及許多微小的 小腺體組成。小鼠唾液腺中最大、最主要的腺體為頌下腺，該腺體多分支分葉，位于頸部腹 側的中間、左右兩只腺體相對。頌下腺靠近頌下淋己結，連接舌下腺，并延伸至背側的腮腺。 頌下腺較小，由單一的分葉構成。腮腺是彌散型的多重分葉，被結締組織和脂肪組織隔開。 而人體中，最大的腺體是腮腺，該腺體呈倒置的錐形，位于外耳的前緣和下緣。腮腺擁有發 達的隔膜，將腺體劃分為許多的小葉，與其他組織隔離開。頌下腺位于二腹肌的前緣，由下 頌舌骨肌分隔為淺表和深表兩部分。而舌下腺位于頌下腺前方，舌頭下方。
[0004] 在小鼠和人中，=個主要的腺體具有一些相似的解剖學結構：腺泡細胞連接于潤 管，匯入小葉導管、然后葉間導管，最后合并進入分泌管，流入口腔。頌下腺和舌下腺的分泌 管開口靠近口齒，而腮腺的導管靠近白齒。而在小鼠的頌下腺中，具有獨特的導管排列：大 顆粒狀的導管連接于潤管和小葉導管之間。小鼠頌下腺的運部分導管具有明顯的雌雄異形 性，與雌性相比，雄鼠中線性排列的導管細胞更大，呈明顯的柱狀顆粒形。運種性別的二形 性是由雄激素決定的，而人體中不存在運種差別。
[0005] 腺體干細胞或祖細胞，具有修復損傷和組織再生的功能。細胞標記實驗和導管結 扎實驗證實，腺體干細胞或祖細胞存在于腺體的導管中。利用核巧酸類似物，如漠脫氧鳥巧 (BdU)和化-胸巧，標記的增殖細胞主要定位于唾液腺的分泌管和潤管中。結扎唾液腺的主 要分泌導管，使得腺泡細胞調亡，引起潤管和分泌管細胞增殖。去結扎后，運種導管結扎引 起的功能喪失會得到恢復，通過導管細胞的增殖和分化，唾液分泌量會快速恢復到結扎前 的水平。上述研究闡明，腺泡細胞的增殖能力有限，不可能恢復腺體功能；而棲息于唾液腺 導管處，具有增殖和分化能力的運群細胞，可能是有效的腺體干細胞或祖細胞類群。
[0006] 2頭頸部癌與口干癥
[0007] 迄今為止，放療和化療依然是世界范圍內癌癥治療的主流。由于較高的存活率，全 球每年有接近50萬人接受頭頸部癌的化療。研究證實，藥物方式的改善可W調和射線照射 產生的副作用。但由于頭頸部復雜的生理結構和發病位置的不確定性，使得頭頸部癌的治 療及其困難，藥物干預對減輕放療引起的副作用十分有限。因此，大約40%的患者會遭受由 福射導致的腺體功能失調及其引發的副作用一一口干癥。
[000引 口干癥是頭頸部癌放療后最突出的并發癥，放療引發唾液腺的損傷，改變了唾液 的分泌量、粘稠度和pH值，讓原本稀薄、中性的唾液變得濃稠、酸性增加。患者口腔不適或疼 痛，說話、巧嚼、吞咽困難，也增加了蛙牙和口腔感染的風險，最終導致食欲下降和體重減 輕。
[0009]盡管放療和藥物治療對頭頸部癌患者是有利的，但福射引發的口干癥，不僅本質 上降低了患者的生活質量，也給他們帶來了新的健康問題。因此，我們需要采取新的診療技 術手段，來提高頭頸部癌患者的生活質量。
[0010] 3干細胞治療
[0011] 接受放療之后，唾液腺功能的恢復主要取決于福射的劑量和腺體自身干細胞的數 量。除了幾十年前放療之后用于造血系統重建的骨髓移植之外，利用干細胞治療減少其他 組織的并發癥依然是一個全新又快速發展的研究領域。近十年來，干細胞治療作為再生醫 學中一種潛在的方案，能夠治愈多種組織或器官功能失調相關的疾病。
[0012] 福射引起的唾液腺損傷，主要是干細胞產生足夠多成熟的功能性細胞的能力不足 造成的。有趣的是，大多數非功能性導管放療后依然完整，運為干細胞移植到合適的環境、 再生唾液腺提供了機會。預防藥物匹魯卡品和角化細胞生長因子化GF)就是由于刺激導管 干細胞或祖細胞的增殖而起到保護腺體的作用。骨髓來源的細胞分泌的因子也會刺激導管 干細胞或祖細胞，一些研究也聲稱，福射損傷的唾液腺也可W由間充質干細胞取代，運些細 胞能夠轉分化形成腺泡樣的表型。
[0013] 目前的研究主要集中在組織自身干細胞的鑒定、分離和移植方面。小鼠和人的唾 液腺干細胞能從培養的唾液球中分離獲得，但真正的唾液干細胞鑒定依然難W捉摸。C-Kit +細胞具有顯著改善射線損傷的能力，CD24/CD29、CD49f和CD133表達的細胞同樣能分化為 所有的腺體細胞類群，并能讓福射后的唾液腺再生。在口干癥的干細胞治療中，研究人員取 得了一些進展，但在臨床應用之前，我們需要解決細胞本身的安全問題。
[0014] 4干細胞體外培養技術
[001引傳統的平面培養方法，在適當的細胞因子條件下，能夠讓多能干細胞和腫瘤細胞 在體外形成穩定的細胞系。然而，許多組織或器官來源的成體干細胞，卻無法在體外獲得穩 定的擴增。得益于對干細胞微環境W及控制干細胞穩定和分化的重要信號功能的認識，體 外=維培養技術得到了快速的發展。運種由干細胞驅動，形成近似生理結構、在體外自我更 新的微組織，被稱作"類器官體"（organoid)。
[0016] 已有報道稱，高效的=維培養體系可W在體外獲得無限量的干細胞或祖細胞，從 食道、胃、小腸、直腸、膜腺到前列腺。不同于傳統的體外培養，運種S維培養體系能夠長時 間擴增小鼠或人的原代上皮"類器官體"，并能在體外維持類器官體基因型和表型的穩定 性，而且類器官體在組成和結構上與原始組織相似。
[0017] 類器官體的出現是傳統平面培養和在體模型的重要橋梁，運一技術較平面培養能 更好地模擬體內的生理環境，在微環境組分、信號通路和基因編輯上比在體模型更容易操 控。在當今個體化醫療的時代，類器官體技術為再生醫學、腫瘤發生和藥物檢測開拓了全新 的視野。
【發明內容】
[0018] 本發明的目的在于提供一種小鼠唾液腺類器官體的體外培養方法
[0019] 本發明所采用的技術方案為：
[0020] -種小鼠唾液腺類器官體的體外培養方法，具體為將原代或傳代唾液腺單細胞與 基質膠混合后，加入干細胞培養液進行培養。
[0021] 進一步地，所述干細胞培養液中的細胞因子包括EGF、IGF、FGF10、Noggin、 Rspondinl和Y-27632。
[0022] 進一步地，所述干細胞培養液由W下成分組成:DF+10 %FBS，100 X N2，50 X B27， lOOXGlutamax'lOOX肥AA,50ng/ml EGF,50ng/ml IGF,100ng/ml FGF10,100ng/ml Noggin,200ng/ml Rspondinl和IOmM Y-27632。
[0023] 進一步地，所述基質膠為Matrigel基質。
[0024] 進一步地，所述原代唾液腺單細胞為采用機械消化和酶消化法處理小鼠唾液腺組 織，并用冷刺激分離獲得。
[0025] 進一步地，培養所述原代唾液腺單細胞時，接種細胞的密度為1~2xl04cells/孔/ 每50uL基質。
[0026] 進一步地，所述傳代唾液腺單細胞為采用離屯、分離和酶消化法處理原代培養的細 胞和培養基混合物獲得。
[0027] 進一步地，培養所述傳代唾液腺單細胞時，接種細胞的密度為0.5~lxl04cells/ 孔/每50uL基質。
[0028] 進一步地，所述的小鼠唾液腺類器官體的體外培養方法，包括W下步驟:a)采用機 械消化和酶消化法處理小鼠唾液腺組織，并用冷刺激分離唾液腺原代單細胞;b)按1-2 X 104cells/孔種入有Ma化igel基質的24孔板內，加入干細胞培養;C)培養14天后進行傳代， 按0.5-1 X 104cells/孔種入有Matrigel基質的24孔板內，穩定傳代即獲得所述小鼠唾液腺 類器官體。
[0029] 本發明的內容還包括一種用于小鼠唾液腺類器官體體外培養的干細胞培養液，由 W下成分組成：DF+10 %FBS，100 X N2，50 X B27，100 X Glutamax，100 X 肥AA，50ng/ml EGF， 50ng/ml IGF,lOOng/ml FGF10，100ng/ml Noggin，200ng/ml Rspondinl和IOmM Y-27632。
[0030] 首先，本發明證實了小鼠唾液腺發育過程中存在=種細胞類群:基底細胞，腔細胞 W及分泌唾液的腺泡細胞。其次，本發明提供了一種小鼠唾液腺類器官體的培養方法和使 用的干細胞培養液，該培養液中每一細胞因子對唾液腺類器官體的增殖具有不可缺少的作 用。本發明的方法獲得的小鼠唾液腺類器官，能夠Wl :50的低細胞濃度比例，穩定傳代1年 W上。對利用該方法培養的類器官體，經RT-PCR和IF檢測mRNA和蛋白表達的狀況，證實該類 器官體包含了所有=種唾液腺細胞類群，在體外模擬了腺體的發育。
[0031] 本發明的有益效果為:本發明建立了體外培養