一種mdck細胞無血清培養基及其用途和制備
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物、醫學領域，具體地是設及一種MDCK細胞的無血清培養基及其用 途和制備。
【背景技術】
[0002] MDCK細胞系（MDCK Cell Lines)中文名稱為"犬腎細胞"是由Madin和Darby于1958 年從美國Cocker Spaniel母曲架犬的腎臟組織分離培育建立，通常是W貼壁方式生長的上 皮樣細胞。目前，MDCK細胞系(MDCK Cell Lines)廣泛用于多種病毒的擴增和純化，如:正粘 病毒科、副粘病毒科、披膜病毒科、瘤疹病毒科、彈狀病毒科、逆轉錄病毒科、呼腸孤病毒科、 黃病毒科、腺病毒科、小RNA病毒科、沙粒病毒科和痘病毒科的多種病毒。由于其病毒感染效 率高、增殖快，且不易變異，MDCK細胞系(MDCK Cell Lines)被公認為最適于甲、乙型流感病 毒疫苗生產的巧巾細胞系之一。傳統的MDCK細胞培養大多采用有血清貼壁培養方式。血清是 由血漿去除纖維蛋白而形成的一種復雜混合物，其含有細胞生長所需的生長因子、激素、載 體蛋白、貼壁因子、微量元素 W及其他營養物質，可W有效地促進細胞生長和產物表達。然 而，血清的應用也存在許多問題：易受病毒、支原體或其他病原體的污染;批間差異造成產 品批次間的質量難W嚴格控制；大量血清蛋白的存在增加了下游分離純化的難度，部分蛋 白難W通過分離純化手段徹底去除，影響了產品的最終質量;此外，血清來源困難、價格昂 貴，大規模動物細胞培養過程中使用血清將會大大增加生產成本。目前還有MDCK細胞使用 某些培養基在傳代多次后會出現致瘤性，運樣會導致疫苗生產的安全性降低。
[0003] MDCK細胞系廣泛用于流感病毒的分離，目前的流感病毒分離包括W下步驟：
[0004] i)在培養基中增殖MDCK細胞；
[0005] ii)用流感病毒樣本感染MDCK細胞；
[0006] i i i)繼續培養，分離在MDCK細胞中復制的病毒。
[0007] 能否快速獲得純度高、滴度高的流感病毒是找出致病因、控制流感疫情中非常重 要的一個環節，因此盡早分離出流感病毒意義重大。在第i)步中，現有的添加血清培養基培 養MDCK細胞分離流感病毒的周期較長，難W滿足流感疫情中快速確定病原物的需要。
[000引本發明就是在此基礎上研究獲得的能夠克服上述缺陷的培養基。
【發明內容】
[0009] 本發明將提供一種能提高MDCK細胞增殖速度和快速收獲流感病毒的培養基。
[0010] 本發明提供一種MDCK細胞培養基，其特征在于包括如下成分:甘氨酸、心精氨酸鹽 酸鹽、1^-天冬酷胺、1^-天冬氨酸、心脫氨酸鹽酸鹽、1^-谷氨酷胺、k谷氨酸、心組氨酸鹽酸鹽、 k異亮氨酸、k亮氨酸賴氨酸鹽酸鹽甲硫氨酸、k苯丙氨酸、k脯氨酸絲氨酸 蘇氨酸、心色氨酸、酪氨酸鄉氨酸、生物素、氯化膽堿、D-泛酸巧、葉酸、煙酷胺、對氨基 苯甲酸、鹽酸化唉醇、鹽酸化唉醒、核黃素、硫胺素鹽酸鹽、維生素 B12、肌醇、硝酸巧(4水）、 硫酸儀(7水）、氯化鐘、碳酸氨鋼、氯化鋼、憐酸氨二鋼、葡萄糖、還原型谷脫甘膚(還原型）、 肥陽S、酪紅鋼鹽。
[0011] 進一步，其還包括如下成分:硫酸銅（5水）、硝酸鐵(9水）、硫酸亞鐵(7水）、氯化儀 (無水）、硫酸鋒(7水）、憐酸二氨鋼(1水）、丙酬酸鋼、腐胺鹽酸鹽、白蛋白。
[0012] 進一步，各成分含量如下(所述含量單位為mg/L):甘氨酸0.1-300、k精氨酸鹽酸 鹽0.1-500、心天冬酷胺0.05-200、心天冬氨酸0.05-200、k脫氨酸鹽酸鹽0.1-200、k谷氨 酷胺0.1 -500、k谷氨酸0.01 -200、k組氨酸鹽酸鹽0.1 -300、心異亮氨酸0.5-150、k亮氨酸 0.5-150、!^-賴氨酸鹽酸鹽1-350、心甲硫氨酸0.1-150、心苯丙氨酸0.5-300、k脯氨酸0.01-100、k絲氨酸0.01-150a-蘇氨酸0. l-200、k色氨酸0.01-50、k酪氨酸0.05-150、k鄉氨 酸0.05-150、生物素 0.001-0.01、氯化膽堿0.01-50、D-泛酸巧 0.005-20、葉酸0.005-30、煙 酷胺0.005-30、對氨基苯甲酸0.001-50、鹽酸化唉醇0.005-50、鹽酸化唉醒0.005-50、核黃 素0.001-10、硫胺素鹽酸鹽0.01-100、維生素 B12 0.01-75、肌醇0.1-150、硝酸巧(4水)0.1-200、硫酸儀(7水)0.1-150、氯化鐘0.5-500、碳酸氨鋼1-6000、氯化鋼10-10000、憐酸氨二鋼 1-500、葡萄糖1-5000、谷脫甘膚(還原型)0.001-300、肥陽S100-8000、酪紅鋼鹽0.1-200。
[0013] 進一步，各成分含量為(所述含量單位為mg/L):硫5水酸銅(5水)0.001-0.01、硝9 水酸鐵(9水)0.01-0.Ol、7水硫酸亞鐵(7水)0.05-100、氯化儀(無水)0.1- 100、7水硫酸鋒 (7水)0.01-100、1水憐酸二氨鋼（1水)0.1-200、丙酬酸鋼0.1-300、腐胺鹽酸鹽0.001-0.01。 進一步，成分含量如下，所述含量單位為mg/U甘氨酸0.1-300、k精氨酸鹽酸鹽0.1-500 天冬酷胺0.05-200、1^-天冬氨酸0.05-200、心脫氨酸鹽酸鹽0.1-200、1^-谷氨酷胺0.1-500、 k谷氨酸0.01 -200、k組氨酸鹽酸鹽0.1 -300、心異亮氨酸0.5-150、k亮氨酸0.5-150、1^-賴 氨酸鹽酸鹽1-350、心甲硫氨酸0.1-150、心苯丙氨酸0.5-300、k脯氨酸0.01-100、k絲氨酸 0.01-150蘇氨酸0. l-200、k色氨酸0.01-50、k酪氨酸0.05-150、k鄉氨酸0.05-150、生 物素 0.001-0.01、氯化膽堿 〇.〇l-5〇、D-泛酸巧0.005-20、葉酸 0.005-30、煙酷胺0.005-30、 對氨基苯甲酸0.001-50、鹽酸化唉醇0.005-50、鹽酸化唉醒0.005-50、核黃素0.001-10、硫 胺素鹽酸鹽0.01-100、15維生素 B12 0.01-75、肌醇0.1-150、硝酸巧(4水)0.1-200、硫酸儀 (7水)0.1-150、氯化鐘0.5-500、碳酸氨鋼1-6000、氯化鋼10-10000、憐酸氨二鋼1-500、葡萄 糖1-5000、谷脫甘膚(還原型)0.001-300、肥陽S 100-8000、酪紅鋼鹽0.1-200、硫酸銅巧水） 0.001-0.01、硝酸鐵(9水)0.01-0.1、硫酸亞鐵(7水)0.05-100、氯化儀(無水)0.1-100、硫酸 鋒(7水)0.01-100、憐酸二氨鋼(1水)0.1-200、丙酬酸鋼0.1-300、腐胺鹽酸鹽0.001-0.01。
[0014] 進一步，其PH值為7.0-7.6。本發明還提供一種培養MDCK細胞的方法，其特征在于 使用上述培養基培養。
[0015] 本發明還提供一種MDCK培養基的檢測方法，其特征在于從如下幾個方面檢測細胞 培養基:滲透壓、內毒素指標、無菌性、支原體檢測。
[0016] 本發明還提供一種MDCK培養基的制備方法，其特征在于包括如下步驟：
[0017] 1)將權利要求1-5之一所述的培養基，用注射用水溶解，
[001引 2)調節PH值，
[0019] 3)用工業濾忍過濾，
[0020] 4)在氮氣保護下分裝。
[0021] 本發明的培養基還有穩定性好、可質控的特點。
[0022] 不經過血清馴化的MDCK細胞，前5代左右的細胞狀態(細胞生長相對緩慢，鏡下觀 察的細胞有小的空泡)會稍差，之后狀態恢復正常，連續傳代后，細胞倍增時間、細胞飽滿比 用DMEM+10%胎牛血清培養的更好。因培養基成分限定，分離流感病毒快，能極大的方便用 戶。
[0023] 本發明制備工藝全部采用在線清洗及在線滅菌設備，保證批間差的穩定，同時生 產中采用惰性氣體氮氣保護，避免不穩定性成分被氧化，該工藝生產的MDCK細胞無血清培 養基質量穩定，解決了大多數廠家生產質量不易控制的問題。
[0024]
[0025] ^^1為用1號培養基培養的100(細胞第50代細胞200倍下顯微照片
[0026] 附圖2為用2號培養基培養的MDCK細胞第50代細胞200倍下顯微照片
[0027] 附圖3為用3號培養基培養的MDCK細胞第50代細胞200倍下顯微照片 [002引
【具體實施方式】
[0029] 實施例1
[0030] 按如下配比稱取試劑，溶劑為蒸饋水，其最終的濃度單位為mg/L，并調節PH值為 7.2,通過工業濾忍過濾，同時氮氣保護進行分裝:甘氨酸30、k精氨酸鹽酸鹽84、k脫氨酸 鹽酸鹽63、心谷氨酷胺584、k組氨酸鹽酸鹽42、心異亮氨酸105 a-亮氨酸105、心賴氨酸鹽 酸鹽146、k蛋氨酸30、1^-苯丙氨酸66、k絲氨酸42、k蘇氨酸95、k色氨酸16、k酪氨酸二鋼 鹽104 a-鄉氨酸94、維生素類、氯化膽堿4、D-泛酸巧4、葉酸4、煙酷胺4、鹽酸化唉醇4、核黃 素0.4、硫胺素鹽酸鹽4、肌醇7.2、氯化巧(無水)200、硝酸鐵(9水)0.1、硫酸儀(無水)97.67、 氯化鐘400、碳酸氨鋼3700、氯化鋼6400、憐酸二氨鋼（1水）125、葡萄糖4500、酪紅鋼鹽15、丙 酬酸鋼110。
[0031] 實施例2
[0032] 按如下配比稱取試劑，溶劑為蒸饋水，其最終的濃度單位為mg/L，并調節PH值為 7.2，通過工業濾忍過濾，同時氮氣保護進行分裝：
[0033] k精氨酸鹽酸鹽126、k脫氨酸鹽酸鹽31、k組氨酸鹽酸鹽42、心異亮氨酸52、心亮 氨酸52、k賴氨酸鹽酸鹽73、k蛋氨酸isa-苯丙氨酸32、k蘇氨酸48 a-色氨酸ioa-酪氨 酸二鋼鹽52、k鄉氨酸46、心谷氨酷胺292、氯化膽堿UD-泛酸巧1、葉酸1、煙酷胺1、鹽酸化 唉醇1、核黃素0.1、硫胺素鹽酸鹽1、肌醇2、氯化巧(無水)200、硫酸儀(無水)97.67、氯化鐘 400、碳酸氨鋼2200、氯化鋼6800、憐酸二氨鋼（1水)140、葡萄糖1000、