一株特基拉芽孢桿菌及其應用
【技術領域】
[000。 本發明設及生物技術領域，特別是一株特基拉芽抱桿菌WM03 UBaci Ilus tequiIensis WM031)及其在防治西瓜枯萎病中的應用。
【背景技術】
[0002] 枯萎病（Bli曲t)是西瓜的一種毀滅性病害，在世界各西瓜產區分布廣泛。隨著 我國農業產業結構的調整，西瓜種植面積越來越大，連作障礙已成為制約西瓜生產的重要 因素。西瓜枯萎病是西瓜連作障礙的主要病害之一，其病原菌是尖抱鑲刀菌西瓜專化型 (化sarium oxyporum f. sp. niveum)。隨著西瓜逐年連作和重巷，西瓜枯萎病發生日趨嚴 重，造成西瓜大量減產，一般病田間減產30%~40%，重病田則可減產80%W上甚至絕產，已經 在世界西瓜各大產區造成嚴重的經濟損失，嚴重限制了西瓜生產。雖然可W從篩選抗性品 種、加強栽培等措施進行綜合防治西瓜枯萎病，但目前化學藥劑防治是控制西瓜枯萎病的 重要而有效方法。
[0003] 目前國內已篩選出了一些有效的藥劑，如25%咪鮮胺EC、70%惡霉靈WP、50%多?霉威 WP、50%異菌脈WP、50%咪鮮胺儘鹽WP、32.5%苯甲喀菌醋SC W及30%苯甲丙環挫EC等藥劑對西 瓜枯萎病的有較好的防治效果。但長期使用化學殺菌劑不僅造成西瓜枯萎病菌的抗藥性逐 年增加，同時也會產生農藥殘留等問題，隨著現代社會的發展，人們對環境保護和自身健康 的關注，生防微生物W其低毒、對人類健康安全等優勢，已越來越多的應用于農業植物病害 防治。
[0004] 生物防治是植物病蟲害綜合治理的重要手段，對實現農業的可持續發展具有重大 意義，而分離與篩選高效生防微生物則是實現生物防治的前提。芽抱桿菌(Bacillussp.)是 人類發現最早的細菌之一，分布廣泛，其抑制病原菌的范圍很廣、抗性強、無毒副作用，在動 植物的生物防治中，應用比較廣泛。芽抱桿菌可產生膚類、脂膚類、憐脂類、多締類、氨基酸 類、核酸類等抗菌物質，不同種類的抗菌物質有不同的生物學活性，因此芽抱桿菌所分泌的 胞外抗菌物質能抑制真菌、細菌、病毒等多種致病因子。目前芽抱桿菌用于植物±傳病害的 例子很多，例如在美國獲得環保局商品化或有限商品化生產應用許可的枯草芽抱桿菌的生 防菌株中，GB03、FZB24都可W用于枯萎病的防治。王雅平用分離至絲瓜±壤的枯草芽抱桿 菌(B.subtilus)TG26浸根處理西瓜和煙草幼苗，對西瓜枯萎病和煙草青枯病的田間防效分 另1]73.1%和79.6%，并有明顯的增產效應。特基拉芽抱桿菌（（8曰^11113*6911116郵13)是枯 草芽抱桿菌的近親，可W對多種植物病害菌株產生括抗作用，目前特基拉芽抱桿菌的生防 效果均集中在對由立枯絲核菌、鏈球菌、棉花黃萎病菌等抑菌效果中，其關于對西瓜枯萎病 的生防效果未見報道。
【發明內容】
[0005] 針對上述問題，本發明提供一株從番茄根部分離得到的特基拉芽抱桿菌WM030及 其在防治西瓜枯萎病中的應用： 一株特基拉芽抱桿菌WM〇31(Bacillus tequilensis WM031)，其保藏編號為CCTCC NO: M2016021;所述特基拉芽抱桿菌為革蘭氏陽性菌株，菌體呈桿狀，無鞭毛，兩端純圓，產生楠 圓形芽抱;其菌落呈乳白色，邊緣不規則。
[0006] 進一步，如本發明所述保藏號為CCTCC N0:M2016021的特基拉芽抱桿菌WM031在防 治西瓜枯萎病中的應用。
[0007] 進一步，本發明所述保藏號為CCTCC N0:M2016021的特基拉芽抱桿菌WM031的應用 具體是指:將西瓜苗移栽至大田后，W特基拉芽抱桿菌WM031菌液灌根，400 mL/株，用W防 治西瓜枯萎病。
[000引進一步，本發明所述特基拉芽抱桿菌麗031菌液是運樣獲得的： (1) 挑取保藏號為CCTCC N0:M2016021的特基拉芽抱桿菌WM031接種至菌種保藏培養 基，3(TC連續劃線、挑單菌落培養兩次后，挑取單菌落在菌種活化培養基中，于3(TC，150-200巧m搖床振蕩培養12-24h; (2) 向含有種子培養基的發酵罐中，按照體積比1:9的接種量接種菌株，于25-38°C，通 空氣培養16-24h，得到液體種子； (3) 按體積比10%的接種量向種子培養基中接種液體種子，于30-35°C，150 rpm搖床振 蕩下避光培養24 h，得到活菌體培養物； (4) 取活菌體培養物于4°C、50(K)rpm條件下離屯、15 min,取沉淀用0.85%的無菌生理鹽 水沖洗3次，調節至菌含量為lO^c化/mL,即獲得特基拉芽抱桿菌WM031菌液。
[0009] 本發明提供的保藏編號為CCTCC N0:M2016021的特基拉芽抱桿菌WM031(Bacillus tequilensis WM031)對西瓜枯萎病菌具有強烈的括抗作用，PDA平板對時實驗表明，該菌株 對西瓜枯萎病菌的抑菌帶直徑3.4cm，抑菌率為79.0%，由該菌制備的濃度為IO 7-IO8C化/mL 左右的菌劑，能夠在±壤和西瓜植株中穩定定植。室內防治試驗結果表明，該菌劑接種西瓜 植株后能夠有效防止西瓜枯萎病的發生，與對照相比發病率下降50%(見圖4)。大田試驗結 果表明，生防菌WM031對西瓜枯萎病的防效(76.7%)高于化學藥劑多菌靈的防效(73.3%)。
【附圖說明】
[0010] 圖1為菌株WM031電鏡圖片。
[0011] 圖2為菌株WM031的ieSrDNA序列的鄰接系統發育樹示意圖。
[0012] 圖3為菌株WM05在PDA培養基上對西瓜枯萎病菌的抑制作用示意圖。
[0013] 圖4為菌株WM05對西瓜枯萎病的室內防治試驗效果示意圖。
【具體實施方式】
[0014] 本發明技術方案生產的對植物內生菌劑能夠高效防治西瓜枯萎病菌引起的枯萎 病。W下通過具體實施例詳細說明本發明的實施，目的在于幫助讀者更好地理解本發明的 精神實質，但不作為對本發明實施范圍的限定。
[0015] 實施例設及的培養基： LB固體培養基(菌種保藏培養基）:膜蛋白腺lOg，酵母粉5g，氯化鋼lOg，瓊脂20g，加水 至lL，pH 7.0-7.5; LB培養液(菌種活化培養基）：膜蛋白腺IOg，酵母粉5g，氯化鋼IOg，加水至IL，pH 7.0- 7.5; 種子培養基（液體，1L):K2HP04 4.8g，KH2P〇4 3.5g，（NH4)2S〇4 2g，MgC12 0.16g，CaCl2 0.02邑，船2]?〇04.2出0 0.0024邑，尸6(：13 0.0018邑，]\111(：12.2出0 0.0015邑，口護7.0。
[0016] W上培養基均在121°C滅菌15-30 min。
[0017] LB平板:配制100mL上述LB固體培養基，高壓滅菌后，將融化的LB固體培養基置于 55°C的水浴中，待培養基溫度降到55°C時倒板，IOmlLB固體培養基倒入一個滅菌培養皿中， 打開蓋子，在紫外燈下照10-15分鐘，冷卻后用封口膜密封并倒置放于4°C冰箱中，備用。
[0018] 綠豆湯培養基：300g綠豆于水中煮沸10分鐘，用4層紗布過濾去渣后，定容至1000 mL，高壓 121°C 滅菌 20min。
[0019] PDA平板：馬鈴馨去皮200g切成小塊放入鍋中，加入1000 ml水，加熱煮沸持續20- SOmin，4層紗布趁熱過濾去渣，加入20g瓊脂粉，待瓊脂融化，加入20g葡萄糖，加水補足 1000ml，在121°C滅菌15-30 min后，取出冷卻至55°C，每IOmlLB培養基倒入一個滅菌培養皿 中，打開蓋子，在紫外燈下照10-15分鐘，冷卻后用封口膜密封并倒置放于4°C冰箱中備用。
[0020] 西瓜枯萎病菌(Fusarium O巧porum f. sp. niveum，）由江蘇農科院食檢所產地 環境研究室保存提供； 西瓜種子為蘇蜜五號，購于江蘇省江蔬種苗科技有限公司. 實施例1菌株的獲得及菌液制備 1、菌株的獲得 (1) 樣品采集:采集江蘇省南京市江蘇省農業科學院蔬菜基地大棚內的番茄植株根部 適量新鮮植株樣本，用自來水將其表面附帶灰塵泥±沖洗干凈，自然風干，然后將植株根部 組織進行表面消毒：然后依次用75%酒精浸泡1 min和8%NaC10浸泡4 min進行表面消毒處 理，無菌水洗4次； (2) 分離篩選:將根莖葉用無菌剪刀剪開，根和莖切成1 cm左右的小段，放置于LB平板 上;根加水研磨至糊狀，靜置10 min后涂布LB平板，均放置于30 °C培養48 h; (3) 純化:待有培養物長出后，采用平板劃線分離法純化，挑取在最高濃度下生長的菌 落在富集培養基上劃線，直到分離獲得純培養物。
[0021 ]通過上述步驟獲得一株純培養物，申請人將其自命名為菌株WM031，其電鏡照片如 圖1所示;該菌株為革蘭氏陽性菌株，菌體呈桿狀，無鞭毛，兩端純圓，能夠產生楠圓形芽抱。 該菌株在LB培養基上其菌落呈乳白色，邊緣不規則。能在25 °C~40 °C的溫度下生長，最適 生長溫度為32 °C ;生長pH范圍為4.0~9.0;最適pH為6.5，其具體理化特性如表1所示： 表1菌株WM031理化特性
*+代表反應呈陽性，-代表反應呈陰性(+ positive reaction, -negative reaction) 菌株胖1031的168扣難系統發育分析圖如圖2所示，在66116曰114(網址^1口：// 訊麗.]1誠;[.]11111.]1比.旨〇￥/)網站上用化451'程序與已登錄細菌菌株的168扣魁基因序列進行 比較，結果表明與8曰(3；[11113 16911；[16]1313.相似性最高，可^達到99°/擬上。