一種菲降解菌Acinetobacter tandoii LJ-5及其應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明屬于生物技術領域，具體設及一種菲降解菌Acinetobacter tandoii LJ-5 及其應用。
【背景技術】
[0002] 多環芳控(PA化)是受到廣泛關注的一類環境污染物質，在環境中普遍存在且不斷 積累。菲(phenant虹ene)是一種S環芳控，它與PAHs的致癌性有著非常密切的關系，憑借其 獨特的化學結構，菲成為PAHs研究的模式化合物化i et al. ,2010;劉爽等，2013)。由于菲 具有持久性、致癌、致崎、致突變性及生物累積性等特性，能夠對生態環境和人類健康構成 重大危害(楊軒等，2012)。
[0003] 環境中有毒有害有機污染物的自然衰減主要依賴相關微生物代謝作用，生物修復 技術具有成本低、效果好、無二次污染等優點，因此該方法是目前菲污染修復最具潛力的修 復手段（Samanta et al.,1999;楊秀虹等，2012)。目前，已報道的菲降解菌株包括 Agmenellum sp.、Aeromonas sp.、Alcaligenes sp.、Acinetobacter sp.、Bacillus sp.、 Berjerincki曰 sp.、Burkholderi曰 sp.、Coryneb曰cterium sp.、Cyclotrophicus sp.、 Flavobacterium sp.、Micrococcus sp.、Moraxella sp.、Mycobacterium sp.、 Nocardioides sp.、Pseudomonas sp.、Lutibacterium sp.、Rhodococcus sp.、 Streptomyces sp.、Sphingomonas sp.、Stenotrophomonas sp.、Vibrio sp .、 Paenibacillus sp.等(Zhao et al.,2008)。近年來國內外科研工作者已從自然環境中分 離得到一些菲降解菌，并對其降解性能進行初步研究(侯寧等，2013)。倪雪等從多環芳控污 染區植物體內分離得到兩株具有降解菲能力的寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas sp.)和 假單胞菌屬（Pseudomonas sp.)，該兩株菌在7d內可降解90 %無機鹽培養基中的菲 (IOOmg . [1)(倪雪等，2013)。鄧軍等從長期受PAHs污染的±壤中分離得到1株菲降解菌氧 化節桿菌(Arthrobacter oxydans)，在菲初始質量濃度為50mg ? [1的無機鹽培養液中培養 5d后，菲降解率為60%左右(鄧軍等，2010)。田志剛等從勝利油田附近石油污染±壤采集± 樣，篩選到能W菲為唯一碳源的芽抱桿菌屬，在菲初始濃度為200mg ? [1時，培養96h后的菲 降解率為98.36 % (田智剛等，2011)。目前，由于工礦業、農業等人為活動W及±壤環境背景 值高等因素已經造成了環境中多環芳控的嚴重污染及嚴重超標，并且化工類園區及周邊± 壤、采油區、采礦區、污水灌概區的主要污染物都為多環芳控巧Ij芳等，2011)。因此，篩選出 能有效降解高濃度菲的菌株更具應用價值。
【發明內容】
[0004] 本發明的第一個目的是提供一種菲降解菌Acinetobacter tandoii LJ-5,該菌是 從山東北部某石油污水處理廠中采集活性污泥，W高濃度菲為碳源進行長期馴化，通過多 次篩選和分離純化得到高效的、能降解高濃度菲的菲降解菌;Acinetobacter tandoii LJ-5于2016年3月1日保藏于廣東省微生物菌種保藏中屯、(GDMCC)，地址:廣州市先烈中路100號 大院59號樓5樓，廣東省微生物研究所，保藏編號為:GDMCC No:60010。
[0005] 本發明的菲降解菌Acinetobacter tandoii LJ-5的菌學特性描述如下：
[0006] 該菌經活化W后，在3(TC有氧的條件下在固體營養培養基制成的平板上生長24h 后，能形成直徑為0.5-2.Omm灰白色、圓形、表面光滑、微微向上凸起的、不透明、邊緣整齊、 無芽抱、無鞭毛、革蘭氏染色呈陰性、菌株個體為桿狀的菌落。該菌為專性厭氧菌，其細胞尺 寸大概為0.7-1.0 X 1.0-1.5皿。其細胞的透射電子顯微鏡圖見圖1。
[0007] 分子生物學特性:該菌的DNA G+C含量為41.0%，運個含量正好落在已經報道過的 不動桿菌屬的細菌DNA G+C含量所在的范圍之內；擴增該菌的16s rRNA基因并測序，得到如 SEQ ID NO. 1所示的DNA序列，利用該序列采用鄰位相接法和最小進化法構建系統發育樹的 結果表明，該菌與Acinetobacter tandoii DSM 1497〇t同源性最高，達97.7% ;DNA-DNA雜 交實驗表明該菌和Acinetobacter tandoii DSM 1497〇t雜交結果為90.11±0.8%，高于雜 交閥值70%，說明該菌在分子生物學層面上是屬于Acinetobacter tandoii同一個種的不 同株系，因此將本發明的菲降解菌LJ-5命名為Acinetobacter tandoii LJ-5。
[000引 Acinetobacter tandoii LJ-5應用于菲降解的實驗表明：在30°C，pH 7.0,不添加 化Cl的液體營養培養基的培養條件下，Acinetobacter tandoii LJ-5能夠很快地降解菲， 在菲初始濃度為100-200mg ? 1/1的無機鹽培養基培養3天后，降解率均可達80% W上;在菲 的初始濃度在400-1000111肖-[1的無機鹽培養基培養7天后，降解率均可達到60%^上;說明 Acinetobacter tandoii LJ-5是一種降解菲及耐受菲能力均很強的菌株。菲常常作為多環 芳控類的模式化合物，因此可W預見該菌對多環芳控具有較好的耐受性和降解性。因此，本 發明的第二個目的是提供菲降解菌Acinetobacter tandoii LJ-5在降解多環芳控中的應 用，進一步的，菲降解菌Acinetobacter tandoii LJ-5在降解菲中的應用。
[0009] 本發明的Acinetobacter tandoii LJ-5是在活性污泥中分離并鑒定的新型不動 桿菌屬的菌株，關于Acinetobacter tando i i對PAHs降解研究國內外還未見報道； Acinetobacter tandoii LJ-5能W高濃度菲作為碳源從而有效降解，該菌在菲初始濃度為 50-200111旨-[1環境下培養3天后，降解率均可達80%^上;在菲的初始濃度為400-1000111邑-[1環境下培養7天后，降解率均可達到60% W上;該菌是一種降解菲及耐受菲能力均很強的 菌株，對多環芳控適應性強;在多環芳控污染環境的生物修復中具有很好的應用前景。
[0010] 本發明的Acinetobacter 1:andoii LJ-5于2016年3月1日保藏于廣東省微生物菌 種保藏中屯、(GDMCC)，地址:廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，廣東省微生物研究所，保 藏編號為:GDMCC No:60010。
【附圖說明】
[0011]圖1是Acinetobacter tandoii LJ-5的形態，其中（a)為固體營養培養基上生長的 Acinetobacter tandoii LJ-5群落；（b)為Acinetobacter 1:andoii LJ-5透射電子顯微鏡 圖：無鞭毛，比例尺為0.5皿；（C)為Acinetobacter tandoii LJ-5透射電子顯微鏡圖，比例 尺為化m。
[0012] 圖2是利用鄰接法構建的Acinetobacter tandoii LJ-5和其相關菌的基于16s rRNA基因序列的系統發生關系，自展值設定重復1000次，圖中僅展示了自展值大于50%的 結果，比例尺0.Ol代表每個核巧酸的替換率，LJ-5T代表Acinetobacter tandoii LJ-5。
[0013] 圖3是利用最小進化法構建的Acinetobacter tandoii LJ-5和其相關菌的基于 16s rRNA基因序列的系統發生關系，自展值設定重復1000次，圖中僅展示了自展值大于 50 %的結果，比例尺0.005代表每個核巧酸的替換率，LJ-5T代表Acinetobacter tandoi i U-5。
[0014] 圖4是不同生長條件對Acinetobacter tandoii LJ-5的影響，其中（a)pH，（b)溫 度，（C)耐鹽度。
[0015] 圖5是Acinetobacter tandoii LJ-5在含不同濃度菲的無機鹽培養基中生長曲 線，菲的初始濃度為IOO-1000 mg ? [1。
[0016] 圖6是Acinetobacter tandoii LJ-5在含不同濃度菲的無機鹽培養基中菲降解情 況，菲的初始濃度為IOO-1000 mg ? [1。
【具體實施方式】
[0017] W下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[001引實施例1
[0019] 1材料
[0020] 1.1樣品來源
[0021] 從山東北部某石油污水處理廠中采集活性污泥，W高濃度菲為碳源進行長期馴 化，通過多次篩選和分離純化得到高效的菲降解菌LJ-5。
[0022] 1.2培養基
[0023] 1.2.1無機鹽培養基
[0024] 無機鹽培養基用于樣品中微生物的富集培養和純菌條件下菲降解實驗。該培養基 配方見表1(含菲溶液）。
[0025] 表1無機鹽培養基配方
[0026]
[0027] 1.2.2營養培養基
[0028] 營養培養基化B培養基）用于細菌的分離、純化、保藏、活化等常規微生物的培養。 本實驗所用的液體營養培養基種類及成分見表2。若實驗需要配制固體營養培養基，僅需在 原有培養基配方的基礎上增添1.5-2%的瓊脂粉。若菌株的培養條件無特別說明，培養基pH 均調節至7.2。
[0029] 表2營養培養基成分
[0030]
[00川巧法
[0032] 2.1菌株的馴化、篩選和分離
[0033] 將采集的活性污泥加入到無機鹽培養基中，W濃度為1000 mg ? [1的菲作為降解的 底物（即無機鹽培養基中含有1000 mg ? 1/1的菲），放置于30°C培養箱中避光震蕩培養。利用 W菲為碳源的無機鹽培養基進行菌株馴化，7d為一個馴化周期;取10%的接種量轉接到具 有相同培養體系的新鮮W菲為碳源的無機鹽培養基中并重復上述富集過程，如此重復= 次。
[0034] 將上述獲得的第四代富集培養樣品W稀釋平板法進行涂布分離，樣品用營養培養 基分離。將涂布好的樣品置于原培養溫度條件下培養，經過48小時左右，培養基表面形成明 顯的單菌落，根據菌落的形態大小、顏色、透明度等特征挑取不相同的若干單菌落，并在營 養培養基平板上進行劃線純化，培養。若經過劃線純化的平板上仍能觀察到不同特征的單 菌落，將其再次進行劃線分離，直至在同一平板上只能觀察到相同特征的單菌落為止。實驗 中篩選得到1株對菲有高效降解性能的菌株LJ-5。挑取純化后的LJ-5單菌落到相應液體營 養培養基中培養至對數期，將菌液和無菌的甘油混合分裝至無菌的2ml凍存管中（甘油濃度 為15% )，放置于-80°C長期保存。
[0035] 2.2菌株1尸5的形態特征
[0036] LJ-5是一株從活性污泥中分離出的細菌，經活化W后，在30°C有氧的條件下在固 體營養培養基制成的平板上生長2地后，能形成直徑為0.5-2.Omm灰白色、圓形、表面光滑、 微微向上凸起的、不透明、邊緣整齊、無芽抱、無鞭毛、革蘭氏染色呈陰性、菌株個體為桿狀 的菌落。該菌為專性厭氧菌，其細胞尺寸大概為0.7-1.0 X 1.0-1.5皿。其細胞的透射電子顯 微鏡圖見圖1。
[0037] 2.3菌株1尸5的生理特征
[0038] 本實驗測試了許多LJ-5生理特性，運些生理指標主要是測定菌株LJ-