利用兩輪加菌共培養提高小球藻產量的方法和制備生物飼料的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及微生物和生物技術領域，具體設及一種利用兩輪加菌共培養提高小球 藻產量的方法和制備生物飼料的方法。
【背景技術】
[0002] 小球藻是一種單細胞綠藻，其環境適應性強，易于大規模培養，細胞中含有豐富的 營養物質，廣泛應用于保健食品、飼料、食品添加劑、精細化加工品和作為醫藥制劑原料，其 開發利用已經引起國內外廣泛的重視。我國常見的小球藻種類有蛋白核小球藻、楠圓小球 藻、普通小球藻等，其中蛋白核小球藻藻粉粗蛋白核必需氨基酸含量高，是一種優良的飼料 蛋白源(李國平.蛋白核小球藻粉中氨基酸含量和飼用價值分析.中國野生植物資源.2003， 22(2) :23-25)。蛋白核小球藻還可W清除廢水中不同形態的氮和憐，可用于工廠化水產養 殖廢水的凈化處理(陳海敏等，工廠化水產養殖廢水菌藻聯合處理模式研究.浙江樹人大學 學報，2002,2(4) :64-67),還能利用偶氮染料為唯一氮源和碳源生長，對印染廢水中的偶氮 染料具有較強的脫色能力(鄭金來等，生物降解常見染料的研究進展.環境污染治理技術與 設備，2000，1 (3): 39-43)。因此，如何在提高細胞生長速率，短時間內獲得大量的藻細胞是 開發應用蛋白核小球藻的關鍵技術環節。
[0003] 已有研究表明微藻和微生物之間存在從寄生到共生等廣泛的互作現象，某些微生 物對藻細胞的生長代謝影響顯著某些微生物對藻細胞的生長代謝影響顯著，能促進藻細胞 生長和生化組分的積累[Ueda H,et al.Bacterial communities constructed in 曰rtifici曰I consorti曰 of b曰cteri曰曰nd Chlorell曰 vulg曰ris.Microbes Environment, 2010,25(1) :36-40.]。植物內生菌是能夠定殖在健康植物內，并與宿主植物建立和諧共生 關系的一類微生物。水稻植株含有許多內生微生物，是重要的內生細菌資源，來源于水稻植 株的內生泛菌可W顯著促進宿主水稻的生長，提高其生物量、葉綠素及憐含量的生物學作 用（FengY,et al.Rice endophyte Pantoea agglomeransYS19promotes hostplant growth and affects allocations of hostphotosynthates. Journal ofApplied Microbiology，2006，100(5):938-945.劉佳，等.內生成團泛菌HAUMl對宿主水稻的定殖及 促生作用.湖北農業科學，2011，50 (23): 4820-4824.)。由于小球藻與植物細胞一樣具有葉 綠體，能夠進行光合作用，其生化代謝特征與植物具有相似性，理論上，對植物具有代謝調 節作用的植物內生菌也能影響小球藻的生長和代謝活動，但迄今國內外未見采用包括水稻 內生菌在內的植物內生菌促進小球藻生長及生化組分合成積累的技術研究和應用。
【發明內容】
[0004] 本發明提供了一種利用兩輪加菌共培養提高小球藻產量的方法和制備生物飼料 的方法，應用水稻內生泛菌進行兩輪菌藻共培養，達到快速增加小球藻生長速率的目的效 果。
[0005] -種利用兩輪加菌共培養提高小球藻產量的方法，包括：
[0006] 1)將第一次加入的水稻內生泛菌和小球藻在光照下進行第一輪菌藻共培養，培養 結束后，得到第一輪菌藻共培養液；
[0007] 2)在第一輪菌藻共培養液中再補加第二次加入的水稻內生泛菌，在光照下進行第 二輪菌藻共培養，培養結束后，得到第二輪菌藻共培養液；
[0008] 3)對第二輪菌藻共培養液進行細胞分離，得到小球藻細胞沉淀和內含水稻內生泛 菌的上清菌液。
[0009] W下作為本發明的優選技術方案：
[0010] 步驟1)中，所述的第一輪菌藻共培養的條件為:培養條件均為23°c~33°C，光強 1500~2500LUX，光周期為10~14虹晝/10~Hhr夜，主要為靜置培養，每天搖動培養瓶混勻 2~6次直至培養周期結束，培養周期為6~12天。進一步優選，所述的第一輪菌藻共培養的 條件為:培養條件均為28°C，光強2000LUX，光周期為12hr晝/1化r夜，主要為靜置培養，每天 搖動培養瓶混勻4次直至培養周期結束，培養周期為8天。
[0011] 所述的第一次加入的水稻內生泛菌和小球藻的菌藻比為1~10000:1，在一定范圍 內，水稻內生泛菌的比例越高，越能夠促進小球藻的生長，越能夠提高小球藻產量。進一步 優選，所述的第一次加入的水稻內生泛菌和小球藻的菌藻比為10~1000:1。
[0012] 所述的水稻內生泛菌可采用市售產品，可采用中國農業微生物保藏中屯、(ACCC)出 售的編碼為10454的水稻內生泛菌菌種。
[0013] 所述的小球藻可W為蛋白核小球藻，也可采用市售產品，可采用中國科學院野生 生物種質庫淡水藻種庫(FACHB)市售的編號為FACHB-1222的蛋白核小球藻。
[0014] 步驟2)中，所述的第二輪菌藻共培養的條件為:培養條件均為23°C~33°C，光強 1500~2500LUX，光周期為10~14虹晝/10~Hhr夜，主要為靜置培養，每天搖動培養瓶混勻 2~6次直至培養周期結束，培養周期為2~12天。進一步優選，所述的第二輪菌藻共培養的 條件為:培養條件均為28°C，光強2000LUX，光周期為12hr晝/1化r夜，主要為靜置培養，每天 搖動培養瓶混勻4次直至培養周期結束，培養周期為4~8天。
[0015] 所述的第二次加入的水稻內生泛菌和第一次加入的水稻內生泛菌的比為0.25~ 4:1。進一步優選，所述的第二次加入的水稻內生泛菌和第一次加入的水稻內生泛菌的比為 1:1，能夠更好地促進小球藻的生長，越能夠提高小球藻產量。
[0016] 步驟3)中，所述的細胞分離包括:第二輪菌藻共培養液先在超聲波條件下處理，之 后離屯、，得到小球藻細胞沉淀和內含水稻內生泛菌的上清菌液。
[0017] 進一步優選，所述的超聲波條件為:在140W~180W、30kHz~50kHz超聲波條件下處 理15s~45s。所述的離屯、為在1000~140化/min低速離屯、3~IOmin。更進一步優選，所述的 超聲波條件為:在160W、40曲Z超聲波條件下處理30s。所述的離屯、為在1200r/min低速離屯、 5min。在160W、40曲Z超聲波條件下處理30s，使水稻內生泛菌細胞和小球藻細胞發生分離， 120化/min低速離屯、5min，使較大的小球藻細胞沉淀下來而較小的水稻內生泛菌仍懸浮上 清中，分別收集沉淀中的小球藻細胞和上清中的水稻內生泛菌細胞。
[0018]本發明中，小球藻細胞沉淀經洗涂重懸后可作為水中偶氮染料降解等污水凈化處 理的生物基料，也可經干燥后獲得蛋白核小球藻細胞產品，作為制備飼料、提取油脂、蛋白、 色素和生長因子等相關生物產品的原料。
[0019] 小球藻細胞沉淀經處理后得到小球藻細胞干品，所述的處理包括:洗涂、離屯、和干 燥，將小球藻細胞沉淀加入蒸饋水重懸洗涂后，經6000~100(K)r/min離屯、5~20min后收集， 之后在30°C~50°C低溫條件下烘干，得到小球藻藻細胞干品。進一步優選，將小球藻細胞沉 淀加入蒸饋水重懸洗涂后，經8000r/min離屯、IOmin后收集，之后在40°C低溫條件下烘干，得 到小球藻藻細胞干品。
[0020] -種制備生物飼料的方法，包括：
[0021] 1)根據所述的利用兩輪加菌共培養提高小球藻產量的方法制備得到小球藻細胞 沉淀；
[0022] 2)將小球藻細胞沉淀經洗涂、離屯、和干燥后得到小球藻細胞干品，將小球藻細胞 干品制成生物飼料。
[0023] 所述的洗涂、離屯、和干燥具體為：將小球藻細胞沉淀加入蒸饋水重懸洗涂后，經 6000~lOOOOr/min離屯、5~20min后收集，之后在30°C~50°C低溫條件下烘干，得到小球藻 藻細胞干品。進一步優選，將小球藻細胞沉淀加入蒸饋水重懸洗涂后，經8000r/min離屯、 IOmin后收集，之后在40°C低溫條件下烘干，得到小球藻藻細胞干品。
[0024] 小球藻細胞干品可直接制作為藻生物飼料，也可W將小球藻細胞干品添加到飼料 配方中，得到復合生物飼料。
[0025] 本發明補菌增藻技術的機理在于:在菌藻互作的共培養過程中，由于采用的是小 球藻適合的培養基和培養條件，共生細菌能夠促進微藻的生長，相反，微藻可能產生細菌生 長抑制物質，如綠藻素等抑制菌細胞的增殖，如此隨著培養周期的延長，菌藻培養液中藻細 胞呈逐漸增長趨勢，而菌細胞數量則逐漸衰減，會越來越少，最后菌藻培養體系中只有極少 量的菌細胞存活。因此，菌對藻的增殖促進作用在一定范圍內隨接種菌藻比的增大而增大， 而且在補菌初期的增藻效果比后期更為明顯，運也是決定本發明所設定的接種菌藻比、共 培養周期時段長短和補菌接種時間的技術基礎。作為優選，本發明W接種菌藻比10-1000: 1，首輪培養8天，第二輪及此后補菌共培養時間W4-8天為主，W達到理想的技術效果。
[0026] 與現有技術相比，本發明具有如下優點：
[0027] 本發明中，蛋白核小球藻活細胞沉淀經洗涂重懸后可作為水中偶氮染料降解等污 水凈化處理的生物基料，也可經干燥后獲得蛋白核小球藻細胞產品，作為制備飼料、提取油 月旨、蛋白、色素和生長因子