一種兩性離子化羥乙基纖維素改性物及其制備方法與用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物功能高分子材料及天然高分子改性材料技術領域，具體設及一種 兩性離子化徑乙基纖維素改性物及其制備方法與用途。
【背景技術】
[0002] 借助毛細管電泳分離與分析蛋白質分子，是目前生物、醫學和食品工程等領域的 重要研究課題。然而，毛細管壁上娃徑基對蛋白質的吸附通常會直接降低毛細管電泳分離 蛋白質的效率和重現性。雖然通過改變緩沖液pH值及組分可在一定程度上上降低蛋白質吸 附，但抑值過高或過低、小分子添加劑濃度過大則易導致蛋白質的聚集和變性。相比之下， 采用親水性聚合物對毛細管內壁表面進行物理或化學改性處理，則能更有效地屏蔽娃徑 基，進而減少蛋白質在毛細管壁上的吸附。迄今為止，已使用的親水性聚合物包括聚丙締酷 胺(PAM)、聚乙締基化咯燒酬(PVP)、聚環氧乙燒(PEO)、聚乙二醇(陽G)、聚N'，N-二甲基丙締 酷胺（PDMA)、聚徑乙基丙締酷胺（P皿A)等合成類高分子，W及殼聚糖（畑itosan)、淀粉 (Starch)、徑乙基纖維素化EC)、徑丙基纖維素化PC)、甲基纖維素 (MC)等天然類高分子或其 衍生物。其中，徑乙基纖維素因其原材料來源豐富、產量大、生物安全性高且易生物降解，其 水溶液作為毛細管內壁表面處理劑一直倍受青睞。但不足的是，徑乙基纖維素本身為不帶 電荷的水溶性中性高分子，用于改性時難W通過物理吸附作用在毛細管內壁表面形成較穩 定的涂層，且所形成的涂層不具有較寬的pH適用范圍，因而難W用于對不同種類、不同等電 點蛋白質大分子的高效分離。
【發明內容】
[0003] 為解決現有技術的缺點和不足之處，本發明的首要目的在于提供一種兩性離子化 徑乙基纖維素改性物的制備方法。
[0004] 本發明的另一目的在于提供上述制備方法制備得到的徑乙基纖維素與橫酸甜菜 堿兩性離子單體接枝共聚物化EC-g-PDMAPS)。該兩性離子化徑乙基纖維素改性物皿C-g-PDMAI^具有良好的涂覆性能，可通過物理吸附涂覆于烙融石英毛細管內壁。
[0005] 本發明的再一目的在于提供上述兩性離子化徑乙基纖維素改性物在毛細管電泳 分離蛋白質中的應用。
[0006] 本發明目的通過W下技術方案實現：
[0007] -種兩性離子化徑乙基纖維素改性物的制備方法，具體包括如下步驟：
[000引將一定量的徑乙基纖維素溶于水(可優選為蒸饋水）中，在惰性氣體保護下加入硝 酸姉錠、乙二胺四乙酸二鋼和3-(2-甲基丙締酷氧乙基二甲胺基）丙橫酸鹽兩性離子單體 (簡稱:橫酸甜菜堿），在25~45°C條件下攬拌反應4~8小時，制得兩性離子化徑乙基纖維素 改性物。
[0009] 上述徑乙基纖維素優選干燥后的徑乙基纖維素，惰性氣體優選氮氣。
[0010] 所述的反應體系中徑乙基纖維素的質量分數為1.0%~3.0%;所述的橫酸甜菜堿 與徑乙基纖維素的質量比為（I :1)~(4:1);所述的反應體系中硝酸姉錠的摩爾濃度為2.5 X 1〇-3~7.5 X l〇-3mol/l;所述的反應體系中乙二胺四乙酸二鋼的摩爾濃度為2.5 X 1〇-3~ 7.5Xl〇-3mol/L。
[0011] 上述攬拌反應結束后，還包括用丙酬進行沉淀并過濾分離，再用甲醇萃取除去均 聚物，干燥得粗產物，將粗產物重新溶于蒸饋水中并透析，冷凍干燥后得到徑乙基纖維素接 枝橫酸甜菜堿單體共聚物，即所述兩性離子化徑乙基纖維素改性物。
[0012] 所述的干燥粗產物是將粗產物在40~60°C條件下真空干燥至恒重，優選干燥24~ 48小時;所述透析是指用截留分子量為14000截流量透析袋透析48~72小時。
[0013] 本發明還提供了一種由上述制備方法制備得到的兩性離子化徑乙基纖維素改性 物。
[0014] 本發明還提供了上述兩性離子化徑乙基纖維素改性物在毛細管電泳分離蛋白質 中的應用，上述兩性離子化徑乙基纖維素改性物可用于改善毛細管電泳分離蛋白質。
[0015] 本發明所得的兩性離子化徑乙基纖維素改性物有效地改善了傳統的徑乙基纖維 素涂層的穩定性，并提高了蛋白質的分離效率。與未改性徑乙基纖維素相比，經接枝共聚得 到的兩性離子化徑乙基纖維素改性物更易附著在毛細管內壁表面形成穩定的涂層，進而減 少蛋白質在毛細管內壁表面的吸附、提高毛細管電泳分離蛋白質的效率;不僅如此，所形成 的改性物涂層還具有較寬的抑適用范圍，可對不同種類、不同等電點蛋白質大分子進行更 有效分離。
[0016] 上述兩性離子化徑乙基纖維素改性物在毛細管電泳分離蛋白質中的應用，包括W 下步驟：
[0017] (1)將未經過修飾的烙融石英毛細管依次用鹽酸溶液、蒸饋水、氨氧化鋼溶液、蒸 饋水在一定氣壓下分別沖洗10~20分鐘，再用空氣干燥10~20分鐘;將一定濃度的兩性離 子化徑乙基纖維素改性物水溶液注入經過預處理的毛細管中并靜置，最后用緩沖液沖洗毛 細管，得到徑乙基纖維素改性物毛細管涂層；
[0018] (2)將制得的徑乙基纖維素改性物毛細管涂層用于電泳分離蛋白質。
[0019]所述的鹽酸溶液的摩爾濃度為0.1~Imol/L，氨氧化鋼溶液的摩爾濃度為0.1~ Imol/l;沖洗毛細管所用的氣壓為10~30psi。
[0020] 所述的兩性離子化徑乙基纖維素改性物水溶液質量濃度為0.1 %~0.5% ;注入和 靜置的時間分別為10~20分鐘;注入所用的氣壓為10~30psi。
[0021] 所述的緩沖溶液為憐酸氨二鋼-憐酸二氨鋼緩沖液、S徑甲基氨基甲燒-鹽酸緩沖 液或乙酸-乙酸鋼緩沖液中的任意一種;所述的緩沖溶液的pH為3.0~5.0;緩沖液沖洗時間 為5~15分鐘，沖洗所用的氣壓為10~20psi。
[0022] 上述步驟(2)的具體操作步驟如下：
[0023] (A)電滲流的測定：
[0024] 電滲流化Iectroosmotic Flow,EOF)的測定采用P/ACE MDQ 3000毛細管電泳儀 (Beckman Coulter,USA)，檢測器為紫外可見檢測器，檢測波長為214nm。毛細管內外徑(ID/ OD)分別為75/375皿，有效長度/總長度化d/Lt)為30/40cm，實驗溫度為25°CdW苯甲醇為中 性標記物;緩沖液是憐酸氨二鋼-憐酸二氨鋼緩沖液，pH值為3.0~8.0，用前經0.45WI1濾膜 過濾。
[0026]
[0025] 采用Williams的方法（Williams BA,et al.Analytical 畑emistry, 1996,68: 1174-1180)進行電滲流的測定。電滲流的數值可由下式計算得出：
[0027]
[002引
[0029]
[0030] 式中，Ld, Lt分別代表毛細管的有效長度和總長度，tNl、tN2、tN3分別是苯甲醇的電泳 遷移圖中先后3個峰的遷移時間，Vprog是電泳實驗時的電壓（1 OkV )，tmigr為電泳時間 (1. Omin)。tramp-up是儀器設定值（0.17min)，tramp-down數值可忽略不計。tinj是進樣時間 (3sec)，td是滯后時間，儀器中一般設定為1.0s。
[0031] (B)蛋白質的分離：
[0032] 蛋白質的分離采用P/ACE MDQ 3000毛細管電泳儀(Beckman Coulter,USA)，檢測 器為紫外可見檢測器，檢測波長為214nm。毛細管內外徑（ID/OD)分別為75/375皿，有效長 度/總長度化d/Lt)為30/40cm，實驗溫度為25°C。緩沖液是憐酸氨二鋼-憐酸二氨鋼緩沖液， pH值為3.0，用前經0.45皿濾膜過濾。
[0033] 溶菌酶、牛血清白蛋白、核糖核酸酶A分別用蒸饋水配制成Img/mL，并等體積混合， 作為待測樣品。將涂層毛細管管先用緩沖液在20psi氣壓下沖洗5min，加電壓20kV于毛細管 兩端預電泳5min，然后在0.5pSi的壓力下注入混合蛋白質樣品，進樣時間為5.