一種新的異香豆素類化合物及其制備方法和醫藥用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥物技術領域，具體涉及從干燥的桂枝中分離得到的一種具有血管保 護作用的異香豆素類化合物及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 桂枝為樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的干燥嫩枝，是常用的解表中藥 之一，主產于廣東、廣西、云南等省區。始載于《神農本草經》，味辛、甘，性溫，具有散寒解表、 溫通經脈、通陽化氣之功效。臨床上多用于風寒感冒、脘腹冷痛、血寒經閉、關節痹痛、痰飲、 水腫、心悸、奔豚等病癥。
[0003] 桂枝為散風寒、逐表邪、止咳嗽、去肢節風痛之要藥，自漢代張仲景《傷寒論》以來， 為歷代醫家所常用。據統計，桂枝在經方中的使用頻率僅次于甘草，在《傷寒論》和《金匱要 略》中多使用桂枝組方。因此，在臨床實踐過程中形成系列以桂枝為主藥的經典方劑，如桂 枝湯、麻黃湯、葛根湯、桂枝茯苓丸、黃芪桂枝五物湯等，廣泛應用于臨床各科疾病的治療。
[0004] 研究表明桂枝中含有以桂皮醛為主的揮發性成分，尚含有有機酸類、縣質類、糖 類、甾體類、香豆素類等成分。
[0005] 藥理學研究證實，桂枝具有緩和腸胃刺激、強心、解熱、擴張皮膚血管、促進血液循 環、解表、發散(汗）、鎮痛、抗真菌、抗血小板凝集、抗腫瘤等作用，且毒副作用低。桂枝中所 含肉桂酸具有抗菌、升高白細胞、利膽、抗突變、誘導人肺癌細胞惡性表型逆轉和抗侵襲等 藥理作用。桂皮醛有明顯的鎮靜、鎮痛作用，并能興奮唾液及胃液分泌而健胃，興奮汗腺而 解熱，舒張支氣管平滑肌而平喘，同時改善外周循環。原兒茶酸即3,4_二羥基苯甲酸，是植 物中抗炎、抗菌的活性成分。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種從干燥的桂枝中分離得到的一種具有血管保護作用的 異香豆素類化合物及其制備方法。
[0007] 本發明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現的：
[0008] 具有下述結構式的化合物(I)，
[0009]
[0010] 所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將干燥的桂枝粉碎，用75~ 85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正 丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中乙酸乙 酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫8個柱體積，再用75%乙醇洗脫10個柱體積， 收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏；（c)步驟(b)中75%乙醇洗脫浸膏 用正相硅膠分離，依次用體積比為75:1、45 :1、20:1、12:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫 得到5個組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1、12:1和5: 1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相 硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~12個柱體積洗脫液，洗 脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。
[0011] 進一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0012] 進一步地，所述用乙醇熱回流提取采用的乙醇濃度為80%。
[0013] -種藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的化合物（I)和藥學上可接受的載 體。
[0014] 所述的化合物(I)在制備血管保護的藥物中的應用。
[0015] 所述的藥物組合物在制備血管保護的藥物中的應用。
[0016] 本發明化合物用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。
[0017] 該藥物組合物含有治療有效量的本發明化合物（I)，其余為藥物學上可接受的、對 人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0018] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發明藥物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質體或乳劑等。
【附圖說明】
[0019] 圖1為化合物(I)結構式；
[0020]圖2為化合物（I)理論E⑶值與實驗E⑶值比較。
【具體實施方式】
[0021]下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對 本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。
[0022]實施例1:化合物(I)分離制備及結構確證
[0023] 試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化 學試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學試劑有限公司。
[0024]制備方法：（a)將干燥的桂枝（10kg)粉碎，用80%乙醇熱回流提取（25LX3次），合 并提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯(3LX3次)和水飽和的正 丁醇(3LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(431g)和正丁醇萃取物；（b) 步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫8個柱體積，再用 75 %乙醇洗脫10個柱體積，收集75 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫物浸膏（157g); (c)步驟(b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為75:1(8個柱體積）、45:1 (8個柱體積）、20:1 (8個柱體積）、12:1 (8個柱體積)和1:1 (5個柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脫得到5個組分；（d)步驟(c)中組分4(49g)用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為 20:1(8個柱體積）、12:1(10個柱體積)和5:1(8個柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3 個組分；（e)步驟(d)中組分2(25g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度 為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集10-12個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合 物（I)(35mg)。
[0025] 結構確證：HR-ESIMS顯示[M+Na]+為m/z425.1622,結合核磁特征可得分子式為 C22H2607 ,不飽和度為 10。核磁共振氫譜數據 SH(ppm，DMS0-d6,500MHz):H-2(5.19，m)，H-3 (4.27，m)，H-5(2.87，s)，H-7(5.79，s)，H-9(2.94，m)，H-ll(1.65，m)，H-ll(1.41，m)，H-12 (4.67，t)，H-14(2.65，d，J=16.0)，H-14(2.23，d，J=16.0)，H-15(5.79，dd，J = 17.8， 11.2)，H-16(5.11，d，J=11.2)，H-16(4.96，d，J=17.8)，H-17(1.01，s)，H-19(1.38，s)，H-20(1 · 07，s)，12-0Ac(2 · 07，s);核磁共振碳譜數據δ。(ppm，DMS〇-d6，125MHz): 210 · 7(C，1 -C)， 75.6(CH，2-C)，69.1(CH，3-C)，46.1(C，4-C)，58.2(CH，5-C)，193.7(C，6-C)，126.3(CH，7-C)，155.2(C，8-C)，47.1(CH，9-C)，41.6(C，10-C)，11.7(CH2，11-C)，76.4(CH，12-C)，41.1 (C，13-C)，42.8(CH2，14-C)，138.9(CH，15-C)，116.3(CH2，16-C)，25.0(CH 3，17-C)，175.1(C， 18-C)，12.1(CH3，19-C)，17.1(CH3,20-C)，170.3(C，12-0Ac)，20.7(CH 3，12-0Ac);碳原子標 記參見圖1。該化合物在229nm處有紫外吸收帶，說明含有α，β-不飽和酮羰基基團。4和 13C-NMR 譜顯示了三個甲基[δHl·01(H-17)，l·38(H-19)和l·07(H-20);δC25·0(C-17)，12·l(C-l9)和17·l(C-20)]，一個2，18-內酯結構[δH5·19(H-2) ;δC75·6(C-2)和175·l(C-18)]，一個 〇，0-不飽和酮羰基[5!15.79(!1-7)4(：193.7((：-6)，126.3((：-7)和155.2((：-8)]，一個酮羰基 [30210.7(01)]，乙烯基[3!15.79(!1-15)，5.11(!1-16)和4.96(!1-16) ;3(：138.9((：-15)和 116.3(016)]，一個乙酰氧基[δΗ2.07( 12-0Ac)jC170.3( 12-0Ac)和 20.7( 12-0Ac)]。含氧 碳信號SC69.1以及氫質子信號δΗ4.27表明C-3位連有一個羥基。HMBC譜中，質子信號δΗ4.67 與相應酯羰基碳δ(：170.3的相關性表明C-12(SC76.4)位連有一個乙酰氧基。此外，N0ESY譜 中H-9與Η-3，Η-12，Η-11β和Me-17的相關性表明這些質子為β構型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜 和NOESY譜，以及文獻關于相關類型核磁數據，可基本確定該化合物如圖1所示，立體構型進 一步通過E⑶試驗確定，理論值與實驗值基本一致(圖2)。
[0026]實施例2:化合物（I)藥理作用試驗 [0027] 一、材料和儀器
[0028]血管內皮細胞(ECV-304)由山東大學醫學院免疫教研室饋贈。化合物（I)自制，制 備方法見實施例1，HPLC歸一化純度大于98 %。RPMI-1640干粉培養基、胰蛋白酶購于美國 Gibeo公司。胎牛血清購于天津TBD公司。MTT、瓊脂糖、AnnexinV-FITC購于美國Sigma公司。 0)!1、10^、500、65!?^測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。0150購于中國醫藥(集團） 上海化學試劑有限公司。蘇木素購于福州邁新生物技術有限公司。Rhodaminel23購于美國 Solarbic公司。陽性藥川考嗪購自上海源葉生物科技有限公司。
[0029] 倒置光學顯微鏡（日本OlymPus公司），二氧化碳培養箱(美國Forma Scientific公 司），電子分析天平(ER-182A型）（日本A&D公司），超凈工作臺（ZHJH-1209型）（上海智城分析 儀器制造有限公司），流式細胞儀(FACS Vantage型）（美國Beeton Diehnson公司），恒溫振 蕩器（江蘇太倉市實驗設備廠），1420Vietor3多標記分析儀（美國PerkinElmer Lifescience公司），721型可見紫外光柵分光光度計(上海精密科學有限公司），電熱恒溫水 浴箱(上海醫療儀器三廠生產），酶聯免疫檢測儀(11(3 11111^81^111)(上海1'1161'1]1〇]^385^七6111 分析儀器公司）。
[0030] 二、試驗方法
[0031] 1、細胞培養
[0032] ECV-304細胞以RPMI-1640培養基于37°C，5%⑶2培養箱中傳代培養。鏡下觀察，待 細胞匯合率達到70%以上時用胰蛋白酶消化傳代，以生長穩定的第3-5代細胞制備細胞懸 液。
[0033] 2、細胞分組及處理
[0034]取生長良好的ECV-304細胞制成細胞懸液，接種于96孔、24孔、6孔細胞培養板或培 養皿中，37°C，5%C02培養24h。隨機分為六組:①正常組;②