基于lamp技術檢測李痘病毒的引物、試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種基于LAMP技術檢測李痘病毒的引物、試劑盒及檢測方法，屬于生 物技術領域。
【背景技術】
[0002] 李痘病毒Plum pox virus，PPV是核果類果樹危險性最大的病毒之一，果樹一旦受 其侵染，則會造成未成熟果實大量脫落，使產量嚴重降低，并且使果實品質大幅度下降，而 且該病毒傳播速度快，在短時間內即可能給整個國家的果樹業發展帶來災難性損失。該病 毒1915年在保加利亞首次被發現，而后迅速傳遍歐洲大多數國家W及地中海、中非、印度和 智利，目前美國和加拿大也有其發生的報道。由于該病毒危害性及其嚴重，因此它已被歐洲 植保組織列入了 A2類檢疫性病原物，其它國家也對其表現出極高度的重視，紛紛加大對其 研究的力度并制定了一系列嚴格的檢測和根除措施，防范于未然。目前中國暫未有發現有 關該病毒的正式報道，由于目前我國同其他國家種質資源交流越來越頻繁，為了防止該病 毒隨著苗木等繁殖材料的引進而進入我國，W保護我國農業的健康和可持續發展，必須加 強對該病毒的檢驗檢疫。
[0003] 目前，我國出入境植物病毒檢測所采用的主要技術方法是酶聯免疫吸附化ISA檢 測和反轉錄聚合酶鏈式反應RT-PCR檢測。傳統的ELISA技術在實際應用過程中存在檢測靈 敏度低，檢測耗時長，容易出現假陽性結果;RT-PCR技術雖然靈敏度高，但是存在RNA抽提繁 瑣并且容易降解，PCR反應容易受寄主中多酪、多糖物質的干擾，難W實現植物病毒病害樣 品的快速、簡便、高效檢測。因此，建立新的快速、簡捷、靈敏的檢驗檢疫技術手段已經迫在 眉睫。
[0004] 植物病毒病的診斷和病原鑒定，是認識病毒病害、防治病毒病的基礎，也是植物病 毒分類學研究的一個重要內容，植物病毒檢測的基本內容包括病毒的生物學特性、形態學 特征、理化特性、基因組結構、抗原特性等幾個方面，設及到生物學測定、血清學測定、生理 生化測定、電鏡技術、分子生物學技術等多種手段。目前，我國出入境植物檢疫所采用的檢 測技術的主要手段主要是：口岸現場檢疫、生長季隔離檢疫、指示植物檢驗、血清學檢驗、分 子生物學檢驗。運些手段存在的主要問題為：1:檢測周期長，不符合國務院提出的"加快通 關速度"的精神;2:容易出現假陽性反應;3:檢測方法繁瑣復雜，不利于基層單位實際應用； 4:主要檢測試劑或產品來源于國外公司，不僅購買價格高，而且定購時間長，運些都不能適 應我國經濟快速發展的需要。因此，建立新的快速有效的檢驗檢疫技術手段已經迫在眉睫。
[0005] 目前對病毒的主要技術檢測方法是酶聯免疫吸附化ISA檢測和反轉錄聚合酶鏈式 反應RT-PCR檢測。ELISA可W定性、定量測定樣品中的病毒，是實現目前鑒定病毒的最好手 段之一。但是，血清學反應的必須具備高效的抗血清，另外血清學檢測對一些病毒含量低和 含有干擾測定物質的樣品則不能做出準確的測定，容易出現假陽性的結果，并且存在檢測 時間長的問題，不能滿足目前口岸快速檢測的要求;RT-PCR技術是應用最廣泛的分子生物 學新技術之一，利用RT-PCR技術對病毒的檢測相比化ISA檢測具有靈敏度高的特點，可檢測 的最低病毒含量達到fg水平。目前在RT-PCR技術基礎上不斷衍生出許多新的技術，例如實 時巧光RT-PCR技術，基因忍片技術等，使其應用范圍不斷擴大，特異性和敏感性也不斷提 高，但是運些分子生物學技術存在RNA抽提繁瑣并且容易降解，PCR反應容易受寄主中多酪、 多糖物質的干擾，限制了植物病毒病害樣品的快速、簡便、高效檢測。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是為了克服現有技術中的不足之處，提供一種快速、簡便、高效、準 確性高、特異性強、靈敏性高，基于LAMP技術檢測李痘病毒的引物；
[0007] 本發明另一個目的是提供一種包含上述引物的用于檢測李痘病毒的試劑盒；
[0008] 本發明另一個目的是提供一種采用上述試劑盒檢測李痘病毒的方法。
[0009] 為了達到上述目的，本發明采用W下方案：
[0010] -種基于LAMP技術檢測李痘病毒的引物，其特征在于包括：
[0011] 正向外引物尸3:5'-〇：1'17641'1'1'(：了4〔6464了64(：-3'；
[0012] 反向外引物83:5'-40：4(：了4〔4押0：0：1'(：-3'；
[001引正向內引物FIP:
[0014] 5'-TCCAAGCCAAATAAACGATTTTGAAGTGAGGCACATATTCAAATGAAGG-3'；
[0015] 其中所述正向內引物FIP包含Flc和F2序列：
[0016] F1C：5'-TCCAAGCCAAATAAACGATTTTGAA-3'；
[0017] F2：5'-GTGAGGCACATATTCAAATGAAGG-3'；
[001引反向內引物BIP:
[0019] 5 '-GGAAACGTCGAAACACAAGAAGAGAGGAGGTTGTGCATGTTG-3 '；
[0020] 其中所述反向內引物BIP包括含Blc和B2序列：
[0021] 其中Blc:5'-GGAAACGTCGAAACACAAGAAG-3' ；
[0022] B2:5 '-AGAGGAGGTTGTGCATGTTG-3 '。
[002；3] 環引物；
[0024] LF:5'-CATTTCTCAATGCTGCTG-3'；
[00巧]LB:5，-ACCGCTGGTGATGTTAA-3，。
[0026] -種基于LAMP技術檢測李痘病毒的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括有： 2 X反應液緩沖液 0.日址 引物 ΙΙΟμΙ 酶溶液 bO μ I
[0027] 陽性對照 撕化 對照引物溶液 2日u L 去離子水 1狐qal
[0028] 所述的引物包括：
[00 巧]正向外引物尸3:5'-〇：1'17641'1'1'(：了4〔6464了64(：-3'；
[0030] 反向外引物83:5'-40：4(：了4〔4押0：0：1'(：-3'；
[0031] 正向內引物FIP:
[00；32 ] 5' -TCCAAGCCAAATAAACGATTTTGAAGTGAGGCACATATTCAAATGAAGG-3';
[0033] 其中所述正向內引物FIP包含Flc和F2序列：
[0034] F1C：5'-TCCAAGCCAAATAAACGATTTTGAA-3'；
[0035] F2：5'-GTGAGGCACATATTCAAATGAAGG-3'；
[0036] 反向內引物BIP:
[00；37] 5 ' -GGAAACGTCGAAACACAAGAAGAGAGGAGGTTGTGCATGTTG-3 ' ；
[0038] 其中所述反向內引物BIP包括含Blc和B2序列：
[0039] 其中 B1C: 5 ' -GGAAACGTCGAAACACAAGAAG-3 ' ；
[0040] B2:5 '-AGAGGAGGTTGTGCATGTTG-3 '。
[004。環引物；
[0042] LF:5'-CATTTCTCAATGCTGCTG-3'；
[0043] LB:5 '-ACCGCTGGTGATGTTAA-3 '
[0044] 其中該試劑盒的產品規格:50次。
[0045] 如上所述的試劑盒，其特征在于所述的2 X反應液緩沖液由W下組分組成： P撇.8 的 Tris-HCl 40raM KCl 20mM
[0046] Μ 換化 Ι&βΜ (饑Μ)這化 20(Μ.? Tween20 0.2% Betaine '1'.投Μ
[0047] dNTPs 2.8πιΜ 。
[004引如上所述的試劑盒，其特征在于所述的酶溶液為Bst DM聚合酶和AMV逆轉錄酶混 合液。
[0049] 如上所述的任一種試劑盒，其特征在于在所述反應緩沖液中含有巧黃綠素巧光染 料。
[0050] -種基于LAMP技術檢測李痘病毒的方法，其特征在于包括W下步驟：
[0051 ] A、采用納米磁珠提取待測樣品的RNA;
[0052] B、采用如權利要求5所述的試劑盒，在冰上，按比例取反應液緩沖液、引物、酶溶 液、陽性對照、去離子水放入滅菌管中配制預混液；
[0053] C、將適量待測樣品的RNA加入步驟B中的滅菌管中；
[0054] D、將步驟C中的試管放置在AB7500巧光定量PCR儀中，在63°C下保持恒溫1小時；
[0055] E、如果待檢樣品與陽性對照一樣出現典型的S擴增曲線，則判定為陽性，如果與陰 性對照一樣沒有擴增曲線，而判定為陰性。
[0056] 如上所述的方法，其特征在于步驟A中采用納米磁珠提取待測樣品RNA的具體步 驟：
[0057] a、制樣:取O.lg的帶毒組織加入ImL抽提緩沖液進行研磨；
[0化引 b、清洗納米磁珠:取出免疫納米磁珠到PCR管中，用dd出0反復清洗納米磁珠3次， 在磁鐵的作用下吸去dd出0;
[0059] C、結合:加入1(Κ)化的樣品到PCR管中，用移液槍吸吐混勻樣品和納米磁珠，室溫下 吸附；
[0060] d、清洗:在磁鐵的作用下移去上清，納米磁珠清洗3次；
[OOW] e、裂解:加入50化d地2昭化CR管中，用移液槍吸吐混勻納米磁珠后，95 °C，lOmin;
[0062] f取樣:用磁鐵吸附納米磁珠，待PCR管內溶液澄清后，上清即為待測樣品RNA。
[0063] 如上所述的方法，其特征在于所述的免疫納米磁珠通過W下工藝制作：
[0064] ①納米磁珠的制備
[00化]分別取5.2g 化Cl3 ·細2〇、2.7g FeS〇4 · 7H2〇、0.85mL 12.1moL/L的濃鹽酸溶解于 200mL水中，超聲脫氧，后將W上溶液滴入250血、0.75nK)L/L化0田容液;在80°C下攬拌，反應 結束后，利用磁分離器將所得沉淀從反應介質中分離出來，再用去離子水清洗