產蛋下降重要病毒環介導多重pcr快速檢測引物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及產蛋下降重要病毒環介導多重PCR快速檢測引物，屬于預防獸醫學領 域。
【背景技術】
[0002] 近些年來，我國種禽和蛋禽在飼養過程中因傳染病導致的產蛋下降問題愈來愈嚴 重，主要表現為產蛋量和蛋品質下降，如產蛋量難W達到正常峰值或驟然下降，出現軟殼 蛋、沙殼蛋、薄殼蛋、崎形蛋及小型蛋等，嚴重影響種(蛋)禽的生產性能，造成了巨大經濟損 失。現有研究表明，很多病原均可導致種(蛋)禽產蛋下降，如禽坦布蘇病毒(ATV)、產蛋下降 綜合征病毒(EDSV)、朋亞型禽流感病毒化9AIV)、禽1型副黏病毒(APMV-1)及沙口氏菌等多 種細菌性病原。產蛋家禽的流行病學調查表明，60%W上的產蛋下降病例是由運些病原中的 一種形成單純感染或幾種病原混合感染引起，發病時的臨床癥狀與剖檢病變十分類似，有 的還繼發或并發其他病原而導致誤診或使病情復雜化延誤治療，從而引發更為嚴重的經濟 損失。
[0003] 禽坦布蘇病毒屬于黃病毒科黃病毒屬的RNA病毒，是2010年4月在我國浙江、江蘇 和福建等地新發現的引起開產蛋鴨、種鴨出現W產蛋驟降、低死亡為主要特征的急性高度 接觸性傳染病的病原。該病毒感染產蛋家禽后主要造成產蛋家禽的卵泡膜充血、出血，卵泡 變性、萎縮及癒痕化等，極大的影響家禽的產蛋性能，發病后2天后家禽產蛋率下降達30%- 70%，嚴重的于發病后7~14天停產，部分感染病例出現不可逆性停產。到2014年底，我國東南 沿海及周邊地區均出現該病的流行，除了產蛋鴨和雞，碟、肉鴨和麻雀等均有感染報道，該 病已嚴重危害到我國養禽業的持續健康發展。
[0004] 產蛋下降綜合征病毒屬于禽腺病毒虹型的DNA病毒，是于1976年發現的引起家禽 W產蛋下降為特征的一種傳染病的病原，該病毒感染后主要引起雞群產蛋驟然下降，軟殼 蛋和崎形蛋增加等，故又命名為產蛋下降綜合征1976。不同年齡的雞和鴨均可感染，但幼齡 家禽不表現臨床癥狀。產蛋家禽感染該病毒后，開始發病時有或沒有一般性的下頻、食欲下 降和萎靡不振，隨后蛋殼稱色，接著泛起軟殼蛋、薄殼蛋。病程持續4~10周，產蛋下降幅度 達10%~40%，種蛋解化率降低，出殼后弱維增多，產蛋下降持續4~10周后一般可恢復正常。
[0005] 朋亞型禽流感病毒是正黏病毒科的RNA病毒，現有研究表明該病毒感染產蛋家禽 后同樣可引起家禽的產蛋率、受精率及解化率下降等危害。當20~30周齡種禽感染時，會 出現的呼吸道癥狀，同時產蛋量出現群體性下降，4~5天內產蛋量可下降30 %~70 %，部 分病例的產蛋禽甚至完全停止產蛋。4周后，產蛋禽緩慢恢復產蛋，但達不到感染前的水 平。
[0006] 連接酶依賴的PCR擴增技術是一種基于連接酶的核酸PCR檢測技術，其工作原理 是:在一段人工合成的外源核酸序列的兩端連接與待檢病原核酸序列互補的寡核巧酸序列 作為捕獲探針，利用該捕獲探針與待測樣品中的病原核酸雜交，從而在待檢核酸鏈上形成 一個帶缺口的、首尾靠近的環，隨后在連接酶作用下將該環閉合形成一個完整的環;最后用 針對該環外源核酸序列部分的特異性引物在DM聚合酶催化下進行PCR擴增，達到檢測待測 基因的目的。當檢測多個目的核酸序列時，只需加入將各自特異性的捕獲探針進行雜交，最 后用同一對檢測引物進PCR擴增，即可到達鑒別診斷的目的。因在檢測過程中設及到探針環 化階段，故將該技術命名為環介導多重PCR。該技術不直接擴增待檢核酸，而是通過擴增與 待檢基因特異性雜交的外源基因來達到檢測待檢核酸的目的，既避免了檢測的非特異性， 又因減少了 PCR擴增時的引物數量，使檢測效率和敏感性得到了保證。
[0007] 因此，根據連接酶依賴的PCR擴增技術原理，建立一種可快速鑒別診斷禽坦布蘇病 毒、產蛋下降綜合征病毒、H9亞型禽流感病毒的環介導多重PCR檢測方法作為產蛋家禽產蛋 下降病原的常規性檢測及疫病突發時病原的及時確診是十分有效的，為產蛋下降疫病病原 的早期診斷及防治措施的制定和執行提供可靠的技術支撐。
【發明內容】
[0008] 本發明提供產蛋下降重要病毒環介導多重PCR快速檢測引物。多重PCR方法是基于 連接酶的工作原理，用特異性的捕獲探針與對應的病毒核酸雜交，并在連接酶作用下環化， 隨后應用一對通用引物對環化的、針對不同病原的捕獲探針進行檢測，依據獲得的擴增產 物大小確定感染病原。
[0009] 所述連接酶是指DNA化q連接酶。
[0010] 3種引起產蛋禽產蛋下降重要病毒為產蛋下降綜合征病毒、禽坦布蘇病毒及H9亞 型禽流感病毒，其特異性的捕獲探針序列分別如Seq ID No. l，Seq ID No.2和Seq ID No.3 所示。
[0011] 針對3種病毒核酸捕獲探針的通用檢測引物序列為：上游引物為5'- CTCGGCGCGGGTCTTGTAGTT - 3'，下游引物為5'- CGAGGACGGCAGCGTGCAGCT - 3'。
[0012] 其檢測程序主要分3個階段，第一階段為變性階段，95°C維持5 min;第二階段為連 接酶介導的捕獲探針與模板的雜交及探針環化階段，95°C 50 S，55°C~63°C 5-10 min進 行6個循環;第Ξ階段為PCR檢測階段95°C 30 s，52°C~56°C 30 s，72°C 30 s進行25個 循環，最后72 °C 10 min結束反應。
[0013] 為獲得上述發明目的，本發明采用的技術方案是:依賴于連接酶的環介導多重PCR 擴增方法，包括W下步驟： 1、病原核酸特異性探針的制備:根據GenBank中已發布的產蛋下降綜合征病毒的lOOkd 蛋白基因、禽坦布蘇病毒的衣殼蛋白基因及H9亞型禽流感病毒的血凝素蛋白基因保守區序 列保守區及增強型綠色巧光蛋白（EGFP)基因的部分序列，設計3對引物，運3對引物的特征 在于5'端分別為W上3種病原核酸序列的互補寡核巧酸序列，3'端為外源基因（本發明中為 增強型綠色巧光蛋白基因）核酸序列。W綠色巧光蛋白質粒作為模板，用運3對引物分別進 行常規PCR擴增，獲得的巧巾擴增產物經純化回收后即可作為病毒核酸特異性捕獲探針。
[0014] 2、通用檢測引物的設計:根據3種病原捕獲探針的共有序列（外源基因部分，即增 強型綠色巧光蛋白基因）設計一對反向引物，該對引物的特征在于其與待檢測的病原目的 基因親緣關系遠，特異性的與已環化的捕獲探針上的增強型綠色巧光蛋白基因雜交后，在 DNA聚合酶作用下啟動PCR擴增過程。
[0015] 3、環介導多重PCR檢測方法的建立和優化： (A)環介導多重PCR反應體系的配置，所述環介導多重PCR反應體系總計30 pL，包括 dNTPs 0.3 mM, lOXTaq DNA連接酶反應緩沖液3化，Taq DNA連接酶0.5化，lOXTaq DAN聚合酶反應緩沖液3 pL(含Mgh),化q DM聚合酶0.50 通用檢測引物各8 pmol, 巧中捕獲探針和DM或cDNA溶液各2 pL，加去離子水補足至30 pL，另外配置一份不含樣 品DNA或cDNA的反應液做陰性對照。
[0016] (B)環介導多重PCR的反應程序所有反應均在同一個反應管中完成，主要分3個階 段，第一階段為變性階段，95Γ維持5 min;第二階段為連接酶介導的捕獲探針與模板的雜 交及探針環化階段，95°C 50 S，55°C~63°C 5-10 min進行6個循環;第Ξ階段為PCR檢測 階段95°C 30 S, 52°C~56°C 30 S, 72°C 30 S進行25個循環，最后72 °C 10 min結束反 應。擴增結束后立即進行電泳顯示檢測結果。PCR檢測的特異性還可W通過將PCR產物純化 回收后送生