雞匍匐性狀基因及與雞匍匐性狀相關的dna分子標記的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及基因工程及雞遺傳育種領域，具體地說，設及雞甸筒性狀基因及與雞 甸筒性狀相關的DNA分子標記。
【背景技術】
[0002] 矮小型是脊椎動物的一種常見的異常肢表型，不同的物種具有相似的表型。矮小 表型由相應的基因控制，包括性染色體矮小基因和常染色體矮小基因。甸筒性狀是雞品種 中存在的一種特有的矮小表型，該表型主要特征為腔短身矮、翅膀短小。了解甸筒性狀形成 的分子機理，對甸筒雞的保種和改良工作具有重要的意義，也為人類和其他物種的肢體發 育提供參考和借鑒。
[0003] Landauer和Dunn (1930)提出甸筒性狀是由常染色體上的顯性純合致死基因（Cp) 控制的質量性狀，雜合子個體表現甸筒性狀，顯性純合子表現為致死型，胚胎死亡集中在解 化的第4天，解化早期死亡率為25%，后代中雜合子的成活率基本不受影響，但由于軟骨營 養不良，引起發育遲緩，導致腔骨變短，表現為甸筒性狀。國際上對甸筒性狀的研究已有近 90年的研究歷史，研究學者從形態學、解剖學、細胞學和分子水平對甸筒性狀雞胚胎進行了 相關的研究。早期的研究嘗試用物理指標來判斷胚胎的分離表型，該研究通過早期胚胎24- 25h、48-54h的體節計數的方法或者形態學的方法來確認體節數目W區分純合致死胚胎、雜 合胚胎和正常胚胎。前人研究也表明Cp胚胎軟骨發育不正常、引起發育阻滯。另外， Loewen化al(1957)通過對Cp胚胎和正常胚胎的組織學及組化分析，把胚胎利用海利氏固定 液化elly'sfluid)進行固定，然后進行不同染色來觀察Cp胚胎與正常型胚胎的差異，結果 表明Cp純合胚胎與正常型胚胎的Feulgen染色W及胞質嗜堿性均顯著不同。Wallace等 (1969)通過核酸測定研究表明Cp胚胎與正常型胚胎也存在有顯著差異。此外，研究者對Cp 胚胎的細胞培養W及軟骨發育也進行了相關研究。但運些區分胚胎表型的方法操作復雜、 費用高、耗時長、需要有專口的儀器，在生產中很難大規模推廣應用。因此，開發一種利用分 子標記進行甸筒性狀準確的的檢測方法具有重要的意義。
[0004] 甸筒性狀是一些地方雞種特有的表型，是雞中特有的肢體異常表型。甸筒性狀個 體由于骨骼發育異常，引起發育遲緩、腔骨變短，翅膀變小、身體矮小。甸筒性狀由常染色體 上顯性純合致死基因 Cp控制，因此Cp基因身份最有可能與控制機體骨骼發育的基因及其信 號通路基因相關。興義矮腳雞是原產于我國貴州省的地方品種，具有腔短身矮、體軀勻稱、 肉美味鮮，肉蛋兼用等特點，是一種稀有珍貴的家禽遺傳資源。由于該品種具有特殊的甸筒 性狀而受到廣泛的關注，但是存在解化率低、腔長不一致、個體體重差異較大、腳趾崎形等 發育問題，米易等一些地方雞種也由于攜帶該基因嚴重影響運些地方品種的解化率和生長 發育的整齊度。因此，只有克隆得到Cp基因，才能從根本上解決育種中存在的運些問題，才 能更深入研究甸筒性狀形成的分子機理和地方雞種中篩查該基因。另外，雞作為一個動物 模型，Cp基因的研究也將會為人類和其他脊椎動物肢體發育研究提供參考，也將促進人類 軟骨發育相關疾病的研究。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種與雞甸筒性狀相關的DM分子標記及其應用。
[0006] 本發明的另一目的是提供一種鑒定或輔助鑒定甸筒性狀雞的方法。
[0007] 本發明的又一目的是提供雞甸筒性狀基因。
[0008] 為了實現本發明目的，本發明提供的與雞甸筒性狀相關的DNA分子標記，其位于 雞7號染色體上，用于擴增所述DNA分子標記的引物如SEQ ID NO: 1-2所示。
[0009] 所述DNA分子標記由雞7號染色體上長片段缺失序列（chr7 :21798705-21810600) 的上、下游序列組成，其為：
[0010]〇569 10脈3所示的核巧酸序列；或
[0011] ii)SEQ ID N0:3所示的核巧酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個核巧酸且 表達相同功能蛋白質的核巧酸序列;或
[0012] iii化嚴格條件下與SEQ ID N0:3所示序列雜交且表達相同功能蛋白質的核巧酸 序列，所述嚴格條件為在含0.1 % SDS的0.1 X SS陽或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65°C 下雜交，并用該溶液洗膜;或
[0013] iv)與i)、ii)或iii)的核巧酸序列具有90%W上同源性且表達相同功能蛋白質的 核巧酸序列。
[0014] 本發明還提供所述DNA分子標記在雞分子標記輔助育種中的應用。
[0015] 本發明還提供一種鑒定或輔助鑒定甸筒性狀雞的方法，包括W下步驟：
[0016] 1)提取待測樣品的基因組DNA;
[0017] 2似待測樣品的基因組DNA為模板，利用SEQ ID脈1-2所示引物進行口0?擴增；
[0018] 3)檢測PCR擴增產物;若擴增產物中含有所述DNA分子標記，則判定該個體為甸筒 性狀雞;若擴增產物中不含所述DNA分子標記，則判定該個體不為甸筒性狀雞。
[0019] 步驟2)中PCR反應體系包括:基因組DNA 80-100ng，含Mgh的10 X PCR緩沖液3.0μ1， 2.5mM dNTPs 4.0μ1，2.5υ/μ1 Taq DNA聚合酶 1.扣1，10μπιο1/1 上、下游引物各0.化l，dd此0 補足至總體積25.0μ1。
[0020] PCR 擴增程序:94°C 變性 5min;94°C 變性 30sec，58°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，共 33個循環；72°C延伸5min;4°C保存。
[0021 ]步驟1)和2)中所述待測樣品來源于雞血液或離體的組織器官;步驟3)中檢測PCR 擴增產物采用的方法包括瓊脂糖凝膠電泳、測序或分子雜交等方法。
[0022] 優選采用酪仿法提取待測雞個體的翅靜脈血DNA。
[0023] 本發明還提供用于鑒定甸筒性狀雞的PCR檢測試劑盒，所述試劑盒中包含SEQ ID NO: 1-2所示引物。
[0024] 本發明還提供雞甸筒性狀基因，所述基因位于雞7號染色體上長片段缺失序列 (chr7:21798705-21810600)的中間，該缺失序列包含Cp基因，其身份為IHH基因，即由IHH基 因的半合子缺失引起雞甸筒性狀。該基因具體位于雞基因組地的：21803719-21807290 化nsembl數據庫，Galgal 4版本），其為：
[00巧]i)沈Q ID NO:6所示的核巧酸序列；或
[00%] ii)SEQ ID N0:6所示的核巧酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個核巧酸且 表達相同功能蛋白質的核巧酸序列;或
[0027] iii)在嚴格條件下與SEQ ID N0:6所示序列雜交且表達相同功能蛋白質的核巧酸 序列，所述嚴格條件為在含0.1 % SDS的0.1 X SS陽或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65°C 下雜交，并用該溶液洗膜;或
[002引iv)與i)、ii)或iii)的核巧酸序列具有90%W上同源性且表達相同功能蛋白質的 核巧酸序列。
[0029] 本發明還提供用于擴增所述雞甸筒性狀基因的特異性PCR引物，所述引物如SEQ ID NO:4-5所示。
[0030] 本發明進一步提供含有SEQ ID N0:4-5所示引物的PCR檢測試劑或試劑盒。
[0031] 適用于所述檢測試劑或試劑盒的PCR反應體系包括:基因組DNA50-500ng，含Mgh的 LA PCR緩沖液3.0μ1，2.5πιΜ dNTPs 4.0yl，10mmol/L上、下游引物各0.扣1，LA Taq DNA聚合 酶1.抓，dd出0補足至總體積化.0μ1。
[0032] PCR 擴增程序:98°C 變性 10sec，6(TC 退火 30sec，72°C 延伸 3min，共 30 個循環；72Γ 延伸10min;4°C保存。
[0033] 本發明首次利用生物信息學分析鑒定了雞甸筒性狀的關鍵基因和原因突變，即由 IHH基因的半合子缺失引起，該缺失位點位于C虹7:21798705-21810600,該缺失區域包含唯 一的目的基因 IHH，該基因的全部缺失，導致胚胎的早期致死。另外，本發明巧妙地利用PCR 方法檢測甸筒性狀雞，彌補了常規篩選方法的不足，縮短了篩選周期。本發明還克隆獲得了 雞甸筒性狀基因，該基因及其檢測引物對雞甸筒性狀形成機理的深入研究W及地方雞種中 篩查甸筒性狀基因 W及甸筒型雞品種資源保護、研究和改良工作具有重要的意義，還能夠 促進人類和其他脊椎動物的肢體發育機理的深入研究。
【附圖說明】
[0034] 圖1為本發明實施例1中采用酪仿法提取雞基因組的DNA電泳檢測結果;其中，Μ為 DNA Marker,編號1-8為待測個體。
[0035] 圖2為本發明實施例1中長片段PCR方法擴增雞甸筒性狀基因的電泳圖；其中，Μ為 Ikb DNA Marker,泳道1和5為甸筒型個體擴增出甸筒基因條帶(335化P);泳道2為早死胚胎 未擴增出甸筒基因條帶;泳道3和4為正常個體擴增甸筒基因條帶。
[0036] 圖3為本發明實施例2中甸筒性狀雞個體的PCR產物電泳檢測結果;其中，Μ為6(K)bp DM Marker,編號1-8為甸筒性狀個體的目的片段(234bp)。
【具體實施方式】
[0037] W下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例 均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（Sa