一種依據BnaLCR78基因測定甘藍型油菜含有高油酸的方法
【專利說明】-種依據BnaLCR78基因測定甘藍型油菜含有高油酸的方法
[0001]
技術領域:本發明設及油料作物領域，具體設及一種檢驗和判斷甘藍型油菜是否 屬于高油酸油菜的測定方法。
【背景技術】
[0002] 甘藍型油菜是Ξ大油菜資源中的重要類型，也是在我國廣泛種植的一類典型的油 料作物，其脂肪酸組成分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸對人體的健康，植物 的抗逆W及損傷后的修復都具有重要作用。根據彭埼2011年博±學位論文(彭埼，與甘藍型 油菜脂肪酸組分形成相關新基因的克隆，2011，博±學位論文，湖南農業大學，中國知網數 據庫/CNKI;W下稱彭埼論文）中的敘述，T350078基因是甘藍型油菜"湘油15"開花后35天左 右種子特異表達文庫中的78號EST克隆片段，其基因的DNA全長369bp，cDNA全長237bp，基因 功能未知；同時，該論文公開了該基因的核巧酸序列(彭埼論文的第54頁第1段與第2段）。通 過NCBI數據庫的比對，發現該基因與擬南芥中的一個低分子量，并且富含半脫氨酸的家族 基因 LCR23同源性較高，因此T350078基因又被命名為化aLCR78。通過構建相應的表達載體 將T350078基因轉化擬南芥，發現該基因可能參與油酸的合成代謝。
[0003] 現有技術通過設計引物，WPCR擴增得到BMLCR78基因的編碼序列，然后利用 DNAMAN6.0軟件，分析化aLCR78基因的序列特點，找出W不同模板擴增出來的序列差異;通 過序列差異，初步明確油菜的油酸含量，用于將來進一步提高油菜油酸的相關研究。為了找 到不同材料在基因序列上的差異，需要分別W不同的模板進行基因擴增和測序工作，工作 較繁瑣。
[0004] 另一方面，目前對油菜脂肪酸組成還可通過相關儀器測定得到相關結果，主要有 W下幾種方式：（一）近紅外光譜法:近紅外光譜儀(Near Infrared Spectrum Instrument, NIRS)是介于可見光(Vis)和中紅外(MIR)之間的電磁福射波，美國材料檢測協會(ASTM)將 近紅外光譜區定義為780-2526nm的區域，是人們在吸收光譜中發現的第一個非可見光區。 近紅外光譜區與有機分子中含氨基團（〇-H、N-H、C-H)振動的合頻和各級倍頻的吸收區一 致，通過掃描樣品的近紅外光譜，可W得到樣品中有機分子含氨基團的特征信息，其缺點 為：1.需要大量有代表性且化學值已知的樣品建立模型。運樣，對小批量樣品的分析用近紅 外就顯得不實際了。2.模型需要不斷更新，由于儀器狀態改變或標準樣品發生變化，模型也 要隨之變化了。3.模型不通用，每臺儀器的模型都不相同，增加使用的局限性。4.建模本錢 高，測試用度大。因此，單獨使用該方法得出的結論不可靠。（二)氣相色譜法:用氣體作為移 動相的色譜法。缺點：在對組分直接進行定性分析時，必須用已知物或已知數據與相應的色 譜峰進行對比，或與其他方法(如質譜、光譜)聯用，才能獲得直接肯定的結果。在定量分析 時，常需要用已知物純樣品對檢測后輸出的信號進行校正，因此分析結果的可靠性很大程 度上取決于已知物的選擇，單獨使用該方法得出的結果可靠性不好；（Ξ)液相色譜法:用液 體作為流動相的色譜法。缺點:液相色譜不能由色譜圖直接給出未知物的定性結果，而必須 由已知標準作對照定性。當無純物質對照時，定性鑒定就很困難，運時需借助質譜、紅外和 化學法等配合，因此已知標準的選擇是結果是否可靠的關鍵，單獨使用該方法得出的結果 可靠性不好，另外大多數金屬鹽類和熱穩定性差的物質還不能分析。雖然該缺點可高效液 相色譜法來克服，但是高效液相色譜法分析成本高，儀器昂貴并且維護費用高，分析時間較 長。
[0005] 現有的研究重點往往是通過常規育種和分子育種等手段培育品種，測定油菜中的 油酸含量，作為特定材料是否是高油酸材料的直接依據，而對相應調控基因的序列特點很 少研究，研究基因的序列特點，有針對性的篩選材料進行相關的下游工作，可對選擇、培育 更優質的高油酸材料奠定重要的基礎。
【發明內容】
[0006] 本發明提供可一種含有高油酸的甘藍型油菜的測定方法，含有W下步驟：
[0007] (1)測定甘藍型油菜的化化CR78基因的轉錄存在可變剪切，則所述甘藍型油菜的 油酸含量高；或測定甘藍型油菜的化化CR78基因的轉錄不存在可變剪切，則所述甘藍型油 菜不屬于高油酸油菜。
[0008] 由于基因序列一般同時具有外顯子和內含子，在形成有活性的mRNA編碼序列之 前，需要進行加工，剪切內含子，將外顯子W特定的方式連接起來。WcDNA為模板擴增得到 的基因大多是只保留外顯子的編碼區的序列。本發明發現高油酸含量的油菜的化aLCR78基 因具有可變剪切的形式，而非高油酸含量油菜的BnaLCR78基因不具有可變剪切的形式。本 發明提供了一種測定方法，用來預判油菜作物油酸含量的高低，檢驗和預判是否屬于高油 酸的油菜。
[0009] 進一步的，本發明提供了具體的測定方法，包含W下步驟：
[0010] (1)提取甘藍型油菜的化aLCR78基因的mRNA,反轉錄得到所述mRNA的cDNA，反轉錄 引物的核巧酸序列如序列表SEQ ID NO. 1的核巧酸序列所示；
[0011] (2)對步驟（1)獲得的cDNA進行PCR擴增，PCR擴增的引物核巧酸序列如序列表SEQ ID NO.2和沈Q ID NO.3的核巧酸序列所示；
[0012] (3)對步驟(2)制備得到的cDNA擴增產物測序，得到所述cDNA核巧酸序列；
[0013] (4)將步驟(3)測序得到的cDNA核巧酸序列與化aLCR78基因的核巧酸序列比較，步 驟(3)所述的測序結果既包括含有化aLCR78基因內含子的cDNA核巧酸序列，步驟(3)所述的 測序結果也包括不含化aLCR78基因內含子的cDNA核巧酸序列，則該甘藍型油菜為高油酸含 量的甘藍型油菜;所述化aLCR78基因的核巧酸序列如SEQ ID NO.4的核巧酸序列所示;或將 步驟(3)測得的cDNA的核巧酸序列與化aLCR78基因的核巧酸序列比較，步驟(3)所述的測序 結果均為不含化aLCR78基因內含子的cDNA核巧酸序列，則該甘藍型油菜為低油酸含量的甘 藍型油菜;所述化aLCR78基因的核巧酸序列如SEQ ID NO.4的核巧酸序列所示。
[0014] 同時，步驟（4)所述的BMLCR78基因的核巧酸序列，可替換為待測甘藍型油菜的 化aLCR78基因的核巧酸序列。
[0015] 本發明所述的高油酸為油菜的油酸含量大于或等于60%，所述低油酸為油菜的油 酸含量小于60 %。
[0016] 進一步的，本發明測定方法由W下步驟組成：
[0017] 反轉錄的方法：
[0018] (1)于無菌的離屯、管中加入下表中的試劑(操作于冰上進行）；
[0019] 表1-lRNA反轉錄操作步驟一
[0020]
[0021] (2)混合均勻，65 °C 5min，迅速至于冰上至少Imin;
[0022] (3)再向離屯、管中加入W下試劑(操作于冰上進行）；
[0023] 表1-2RNA反轉錄操作步驟二
[0024]
[0026] 4)混勻后置于 50°C，60min;
[0027] 5)70°C，15min 終止反應
[0028] 6)反轉錄產物可W置于一 20°C下保存 [00 巧]7)PCR 擴增:使用 Bio-Rad 的 PCR 儀 T100;
[0030] 反應程序為：4min at 94Γ，40s at 94Γ，40s at 58Γ，30s at 72°Cfor 35cycles；and 7min at 72°C
[0031] 反應體系為：cDNA模板化L,上下游引物各0.化L，10mM dNTPS 0.祉L，ES Taq DNA Polymerase(抓/yL)0.祉L，10X化lymerase Buffer ：3yL，無菌水體積補足至30化
[0032] 8)對步驟7)擴增得到的cDNA產物進行測序，得到測序結果cDNA的核巧酸序列；
[0033] 9)序列比較，得到序列比較的結果。可將步驟8)得到的測序結果cDNA核巧酸序列 與化aLCR78基因的核巧酸序列比較，步驟8)所述的測序結果既包括含有化aLCR78基因內含 子的cDNA核巧酸序列，步驟8)所述的測序結果也包括不含化aLCR78基因內含子的cDNA核巧 酸序列，則該甘藍型油菜為高油酸含量的甘藍型油菜;所述化aLCR78基因的核巧酸序列如 SEQ ID NO.4的核巧酸序列所示；
[0034] 或將步驟8)測得的測序結果cDNA的核巧酸序列與化化CR78基因的核巧酸序列比 較，步驟8)所述的測序結果均為不含化aLCR78基因內含