基于代謝物及基因表達篩選三七皂苷合成關鍵基因的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及Ξ屯中Ξ祗皂巧合成途徑關鍵基因的篩選，具體的是結合一年生Ξ屯 代謝物含量及Ξ祗皂巧合成途徑關鍵基因的表達量進行典型關聯分析（canonical correlation analysis)，篩選出^屯中對皂巧含量貢獻度較大的Ξ祗皂巧合成途徑關鍵 基因。
【背景技術】
[0002] Ξ^;：；(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.化en)為五加科人參屬植物，是我國傳統珍 貴藥材，其主要生理活性成分為Ξ屯皂巧。Ξ屯的應用在古代主要作為金創要藥，用于體內 外各種出血及跌打損傷、疲滯腫痛的治療。現代藥理學研究表明Ξ屯總皂巧和部分單體皂 巧在血液及屯、血管系統、系統代謝、免疫及抗炎、抗腫瘤等方面均有較好的生理活性，其多 方面的藥理作用及保健功能越來越受到人們的重視。目前Ξ屯皂巧的主要來源是從栽培Ξ 屯提取得到的，然而Ξ屯為多年生草本植物，生長周期長，且生長條件苛刻、地理分布窄，加 之病蟲害嚴重、連作障礙、農藥殘留等問題，其產量已難W滿足快速增長的市場需求。
[0003] 近年來，針對藥用植物次生代謝產物的基因調控已成為分子生物學研究的熱點， 而皂巧類物質是植物次生代謝產物的重要組成部分，其含量和組成主要取決于生物合成關 鍵基因在細胞中的表達水平。在植物細胞中，祗類化合物主要來源于兩個前體物質，異戊締 基焦憐酸（IPP)及其異構體二甲基締丙基焦憐酸(DMAPP)。細胞質中的甲徑戊酸(MVA)途徑 和質體中的2-C-甲基-D-赤薛糖醇-4-憐酸(MEP)途徑都能夠產生IPP和DMAPP，且兩條途徑 所產生的IPP可W穿過質體膜互為對方所用。IPP分子和兩個DMAPP分子在法尼基焦憐酸合 酶(FPS)的作用下生成法尼基焦憐酸(FPP)，兩個FPP分子在整締合酶(SQS)的作用下W頭- 頭方式還原偶聯生成Ξ祗類物質的前體整締。隨后，整締在整締環氧酶(SE)的作用下氧化 成2,3-氧化整締，達瑪燒二醇合成酶(DS)催化2,3-氧化整締環化為達瑪締二醇。達瑪締二 醇是達瑪燒型四環Ξ祗皂巧類的骨架，在細胞色素 P450單加氧酶及多種糖基轉移酶的作用 下最終形成不同類型的達瑪燒型四環Ξ祗皂巧。目前，植物Ξ祗皂巧合成途徑中的一些關 鍵酶基因已在人參屬植物中克隆和鑒定，研究證實它們的表達對Ξ祗皂巧合成起著重要調 控作用。此外，Niu等人對FPS，SS，沈和DS等基因在四年生Ξ屯開花期的表達進行了分析，為 進一步闡明皂巧類物質在Ξ屯中的合成機制打下了基礎。
[0004] 本發明W探索Ξ屯中Ξ祗皂巧合成關鍵酶基因表達水平和代謝物含量的關聯性 為出發點，應用高效液相色譜-質譜聯用系統對一年生Ξ屯不同部位的代謝物含量進行了 分析，同時利用巧光定量PCR技術對其皂巧合成途徑關鍵酶基因表達量進行定量分析，并且 通過典型關聯分析構建了Ξ屯基因-代謝物相關圖，對關鍵基因進行了篩選。在本發明之 前，尚未出現設及基于Ξ祗皂巧含量及其合成途徑關鍵基因表達量對Ξ屯Ξ祗皂巧合成關 鍵基因進行篩選的公開報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于構建Ξ屯生長發育早期皂巧合成關鍵基因和代謝物含量的關 系網絡，篩選Ξ屯植物中對皂巧合成有重要作用的關鍵基因。
[0006] 為了實現上述發明目的，本發明提供的技術方案包括下列步驟：
[0007] 1)分析一年生Ξ屯不同部位皂巧類物質代謝輪廓。
[0008] 2)測定皂巧合成途徑關鍵基因在Ξ屯不同部位的表達。
[0009] 3)構建基因-代謝物關系網絡，篩選Ξ屯中皂巧合成關鍵基因。
[0010] 上述方法中，所述Ξ屯不同部位為一年生Ξ屯的葉、葉柄及根部。
[0011] 步驟1)所述分析皂巧類物質代謝輪廓是采用高效液相色譜-質譜聯用系統對不同 部位樣品甲醇提取物進行檢測，使用內標法通過標準曲線進行定量。分析方法參照Li等人 "Global analysis of chemical constituents in Shengmai injection using high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry"論文 中報道的皂巧定量方法。
[0012] 步驟2)所述Ξ屯不同部位皂巧合成途徑關鍵基因的表達是采用巧光定量PCR(RT- Q-PCR)技術進行檢測的。具體是分別提取樣品RNA，再將RNA反轉錄合成第一鏈cDNA，WcDNA 為模板，按照Takara公司SYBR Premix ExTaq?說明書中針對LightCycler?96實時巧光定 量PCR儀推薦的方法進行設置。
[0013] 上述巧光定量PCR反應中的特異性引物具體序列參見表1。
[0014] 表1 RT-Q-PCR中使用的基因引物序列
[0015]
[0016] 所述實時巧光定量PCR檢測的反應條件為:95°C預變性2min，95°C變性10s，57°C退 火15s，72°C延伸30s，45個循環。
[0017] 步驟3)中所述基因-代謝物關系網絡的構建和生物合成關鍵基因的篩選是通過典 型關聯分析將Ξ屯皂巧含量與皂巧合成途徑關鍵基因表達量相結合分析得到的。具體的是 使用皮爾遜相關系數對皂巧含量及皂巧合成途徑關鍵基因的表達量進行典型相關分析，變 量相關系數高于0.5作為篩選關鍵合成基因的標準。
[0018]本發明基于一年生Ξ屯中皂巧類物質代謝及皂巧合成途徑關鍵基因的表達構建 了基因-代謝物關系網絡，對Ξ屯生長初期皂巧合成關鍵基因進行了篩選，為進一步闡明Ξ 屯中皂巧類物質合成機制提供了重要信息，同時為通過基因調控等手段提高Ξ屯皂巧含量 提供了重要依據。
【附圖說明】
[0019 ]圖1為Ξ祗皂巧類物質在生物體內合成途徑；
[0020]圖2為一年生Ξ屯不同部位皂巧類物質代謝輪廓譜圖，其中A是標準品混合溶液，Β 是一年生Ξ屯葉，C是一年生Ξ屯根，D是一年生Ξ屯葉柄；
[0021 ]圖3為皂巧在不同部位分布及含量熱圖；
[0022] 圖4為一年生Ξ屯不同部位皂巧含量PCA分析圖，其中1是一年生Ξ屯根，2是一年 生Ξ屯葉柄，3是一年生Ξ屯葉；
[0023] 圖5為皂巧合成途徑關鍵基因在一年生Ξ屯不同部位中的表達；
[0024] 圖6為一年生Ξ屯基因-代謝物關系網絡。
【具體實施方式】
[0025] 下面對本發明的實施例作詳細說明，W下實施例將有助于本領域的技術人員進一 步理解本發明，但不W任何形式限制本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均 為常規方法。下述實施例中所用的試劑如無特殊說明，均為市售購買產品。
[00%]實施例1:代謝輪廓分析。
[0027] 1)材料與方法
[00%]所用植物材料來自于本實驗室栽培Ξ屯，Ξ屯種子購于云南省文山州，于2013年 12月播種于溫室，嚴格按照Ξ屯種植標準，保證Ξ屯生長環境的陰涼避光及適宜的溫濕度。 于來年6月對一年生Ξ屯植株的葉、葉柄及根部分別取材，樣品經液氮速凍后，冷凍保存于- 80°C冰箱。
[0029] 2)樣品提取
[0030] 將各樣品研磨成粉末，經48小時的冷凍干燥后用甲醇對樣品進行提取。準確稱量 50mg樣品溶于1.5mL甲醇，滿旋Imin，室溫超聲提取半小時，所得混合溶液過夜靜置， 12000rmp離屯、取上清液。剩余物用甲醇再次提取，超聲處理1小時，離屯、，將兩次離屯、的上清 液混合用于皂巧含量的測定。根及葉柄提取物稀釋2倍，葉提取物稀釋5倍，所有樣品進樣前 經0.22WI1有機濾膜過濾。
[0031] 3)皂巧代謝輪廓分析
[0032] 參考Li等人在"Global analysis of chemical constituents in Shengmai injection using high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrome化y"論文中報道的皂巧定量方法，采用高效液相色譜-質譜聯用技術對上 述樣品提取物進行分析得到不同部位代謝輪廓譜。