大腸菌檢測方法以及其中使用的試劑盒的制作方法
【專利說明】大腸菌檢測方法從及其中使用的試劑盒
[0001 ] 本發明專利申請是國際申請號為PCT/US2009/069629，國際申請日為2009年12月 29日，進入中國國家階段的申請號為200980157395.3，發明名稱為"大腸菌檢測方法W及其 中使用的試劑盒"的中國發明專利申請的分案申請。
[醒]優先權聲明
[0003] 本專利申請要求下述美國臨時專利申請的優先權:2009年12月9日提交的61/267， 860; 2008年 12月31 日提交的61/141,900; 2008年 12月31 日提交的61/141,813;和2008年 12 月31日提交的61/141，685;上述美國臨時專利申請的內容W引用方式并入本文。
技術領域
[0004] 本發明設及用于檢測試驗樣品中微生物的存在的方法。在另一方面，本發明還設 及用于實施運種方法的診斷試劑盒。
【背景技術】
[0005] 在飲用水檢測和食品安全檢測中，大腸菌的存在與否被認為是重要的品質依據， 并且在飲用水和某些食品（例如，乳制品）中允許的大腸菌的量在世界各地的多個國家中是 有規定的。大腸菌包括糞便大腸菌，例如大腸桿菌。食品或水樣品中存在的糞便大腸菌被用 作食品或水的糞便污染W及可能存在的其他病原微生物的主要指示物。
[0006] 用于檢測、鑒定和/或計數水樣品中的微生物的方法可見于（例如）美國公共衛生 協會（American 化blic Health Association)、美國自來水工程協會（American Water Works Association)和水環境聯合會(Water Environment Federation)聯合出版的第21 版綱要 "Sl:andard Methods for the Examination of Water and Wastewater" ("SMEWW") (水和廢水檢驗標準方法KSMEWW描述了下述膜過濾技術，其常常用于水檢測中，W便獲得 W相對低濃度存在于相對大量的水中的微生物的直接計數。在實施運項技術中，使特定體 積的水穿過膜過濾器，將該膜在培養基或裝置中解育特定時間段，隨后將所得微生物菌落 進行計數。膜過濾技術可用于監測樣品的微生物品質，運些樣品來自旨在生產飲用水的工 藝，W及來自于各種天然的、未處理的水源。
[0007] 用于檢測、鑒定和/或計數食品樣品中的微生物的方法通常根據食品的特性W及 可能存在于樣品中的微生物的類型而有所不同。用于檢測食品樣品的方法概要包括：由美 國公共衛生協會（Washington,D.C.)公布的第27版"Standard Methods for the Examination of Daily Products"(乳品檢驗標準方法），W及由美國食品藥品管理局（the U.S.Food and Drug Administration .Washington ,D . C.)公布的"Bacteriological Analytical Manuar ("BAM")(細菌學分析手冊）。通常將固體食品懸浮于水性介質中，并混 合和/或研磨W得到可用于微生物定量分析方法中的食品材料的勻漿液。
[000引然而，上述參考方法通常相對昂貴、設及復雜的步驟、和/或需要相對復雜的儀器 和/或相對較高受訓程度的人員。例如，大多數膜過濾技術需要滅菌設備、真空歧管和結果 的人工判讀。另一個缺點為膜過濾器可被小顆粒(例如，泥沙、粉塵、誘或其他懸浮顆粒)堵 塞ο
[0009] 諸如離屯、之類的技術需要用于采樣大體積(例如，大于50毫升的體積)的專用電源 設備，并且從運種體積中回收相對低數量的微生物需要相對長的時間段。用于樣品的微生 物分析的培養裝置通常可僅容納相對小的樣品種菌體積(例如，大約1毫升）。運種局限性在 水檢測領域中尤其成問題，因為美國環境保護局（U . S . Environmental Protection Agency)水質檢測條例(例如)規定檢測大（100毫升)水樣品體積。
【發明內容】
[0010] 因此，我們認識到迫切需要用于快速檢測、鑒定和/或計數病原微生物的方法。所 述方法將優選不僅快速而且成本低、簡單(不設及復雜的設備或程序）、和/或在多種條件下 (例如，不同類型樣品基質和/或病原微生物、不同微生物負荷、W及不同樣品體積)有效。具 體地講，我們認識到需要用于檢測、鑒定和/或定量試驗樣品（例如，用于飲用水和食品安全 檢測）中的大腸菌的簡單、有效和/或高性價比的方法。
[0011] 簡而言之，在一個方面，本發明提供了用于檢測樣品中存在或不存在大腸菌的方 法。所述方法包括：
[0012] (a)提供至少一個疑似包含至少一種大腸菌菌株的樣品（優選地，為流體形式;更 優選地，水樣品）；
[0013] (b)提供至少一個培養裝置，其包括至少一種水合的或可水合的培養基；
[0014] (C)提供至少一種粒狀濃集劑，其在培養基為水合的情況下與培養裝置中的培養 基相接觸時為基本上光學透明的；
[0015] (d)設置粒狀濃集劑與樣品相接觸(優選地，通過混合進行），使得大腸菌菌株的至 少一部分結合至粒狀濃集劑或被粒狀濃集劑捕集，W形成結合大腸菌的粒狀濃集劑；
[0016] (e)設置結合大腸菌的粒狀濃集劑與培養裝置的培養基相接觸；
[0017] (f)解育包括與培養基(所述培養基為水合的）相接觸的結合大腸菌的粒狀濃集劑 的培養裝置;W及
[0018] (g)在不將大腸菌菌株與粒狀濃集劑分離的情況下，光學檢測大腸菌菌株的存在 (例如，大腸菌菌株的至少一個菌落的存在）。
[0019] 優選地，大腸菌為產氣大腸菌(更優選地，大腸桿菌化schericMa coli))，培養裝 置包括含有至少一種可發酵營養物質的培養基(更優選地，培養裝置為包括含有至少一種 可發酵營養物質的培養基的平膜培養裝置），粒狀濃集劑包括微粒(更優選地，無機微粒）， 和/或光學檢測包括檢測至少一種顏色變化(更優選地，至少一種顏色變化W及鄰近大腸菌 菌株的至少一個菌落的至少一個氣泡的存在）。
[0020] 所述方法還優選包括離析(優選地，通過重力沉降）結合大腸菌的粒狀濃集劑、從 樣品中分離所得離析的結合大腸菌的粒狀濃集劑、鑒定大腸菌菌株、和/或定量或計數大腸 菌濃度。光學檢測步驟可為人工的或自動的。
[0021] 已經發現，某些相對低成本的粒狀濃集劑可有效濃集大腸菌(包括(例如)相對大 體積的樣品（例如，100毫升水樣品）中的相對低含量的大腸菌），使得細菌不但保持活性W 用于檢測或分析，而且令人驚訝地可在存在(并且沒有分離或去除)粒狀濃集劑的情況下進 行光學檢測或分析(甚至通過自動光學檢測系統）。運種粒狀濃集劑可用于濃集存在于樣品 (例如，食品或水樣品）中的大腸菌菌株，w使得可更容易和快速地分析大腸菌菌株中的一 個或多個。
[0022] 令人驚訝地是，用于本發明方法中的粒狀濃集劑通常不會顯著干擾大腸菌代謝 (包括酶和/或氣體產生)和菌落生長，或干擾檢測、鑒定和/或定量大腸菌通常所依據的大 腸菌菌落指示物特性(例如，顏色變化和/或氣泡）。因此，令人驚訝地是，解育和檢測期間所 存在的粒狀濃集劑通常不會顯著降低大腸菌檢測的精確度，包括專口鑒定大腸桿菌(運對 于通過食品和/或飲用水品質檢測來保持公共健康至關重要，如上所述)所需的更嚴格檢 測。
[0023] 本發明的方法可在水檢測中（其中水樣品通常包含相對低數量的大腸菌)提供增 加的采樣效率(例如，相對于0.1 mL常規未濃集的平板接種體積，能夠使樣品體積增加約兩 個數量級和/或使可檢測微生物濃度降低約兩個數量級），并且可通過使用粒狀濃集劑避免 與使用用于濃集的膜過濾器相關的過濾器堵塞問題。通過能夠有效的樣品濃集，所述方法 可與可僅容納相對小樣品種菌體積(例如，約1毫升)的培養裝置相容。
[0024] 本發明的方法相對簡單并且成本低(不需要復雜設備、昂貴的菌株特異性材料或 高受訓程度的人員）并且可在現場相對快速地實施(優選實施例能夠在約22至24小時內檢 測大腸菌），而不需要較復雜現有技術的大腸菌檢測方法(例如，膜過濾)通常所需的專口配 備的實驗室裝置。另外，所述方法可對多種大腸菌和多種樣品（不同樣品基質，并且不同于 至少一些現有技術的方法，甚至為具有低大腸菌含量和/或大體積的樣品）有效。因此，本發 明的方法的至少一些實施例可滿足上述對于在多種條件下快速檢測病原微生物(特別是大 腸菌)的低成本、簡單方法的迫切需要。
[0025] 在另一方面，本發明還提供了用于實施本發明方法的診斷（或樣品檢測)試劑盒， 所述試劑盒包括：
[0026] (a)至少一種培養裝置，其包括至少一種水合的或可水合的培養基;和
[0027] (b)至少一種粒狀濃集劑，其在培養基為水合的情況下與培養裝置中的培養基相 接觸時為基本上光學透明的。
【具體實施方式】
[0028] 在W下詳細說明中，描述了各組數值范圍（例如，特定部分中的碳原子數的數值范 圍、特定組分的量的數值范圍等等），并且在每組數值范圍內，范圍的任何下限可與范圍的 任何上限配對。運種數值范圍另外旨在包括包含在該范圍內的所有數(例如，1至5包括1、 1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等等）。
[0029] 如本文所用，術語"和/或"意指所列要素的一個或全部，或所列要素的任何兩個或 更多個的組合。
[0030] 術語"優選的"和"優選地"是指本發明的實施例在某些情況下可提供一定的益處。 然而，其他實施例在相同或其他情況下也可能是優選的。此外，對一個或多個優選實施例的 表述并不暗示其它實施例是不可用的，且并非意圖將其它實施例排除在本發明范圍之外。
[0031] 當術語"包含"及其變型出現在【具體實施方式】和權利要求中時不具有限制的意思。
[0032] 本文所用的"一種(個)"、"所述(該)"、"至少一種(個rw及"一種或多種(一個或 多個r可互換使用。因此，例如，疑似包含"一種"祀大腸菌的液體樣品可被理解為是指該液 體樣品可包含"一種或多種"祀大腸菌。
[0033] 上述"
【發明內容】
"部分并非旨在描述本發明的每個實施例或每種實施方式。W下具 體實施方式更具體地描述了示例性實施例。在整個【具體實施方式】中，通過實例的列表提供 指導，運些實例可W各種組合使用。在每種情況下，所述列表僅用作代表性的組類，并且不 應解釋為排他性列表。
[0034] 室義
[0035] 利申請中使用的：
[0036] "大腸菌菌株"是指可通過檢測方法區分的特定類型的大腸菌（例如，不同屬的大 腸菌、屬內不同種的大腸菌、或種內不同隔離群的大腸菌）；
[0037] "濃集劑"是指結合包括大腸菌在內的微生物的材料或組合物(優選地，微生物捕 集或結合效率為至少約60 % ;更優選地，至少約70 % ;甚至更優選地，至少約80 % ;最優選 地，至少約90%);
[0038] "培養裝置"是指可用于在將允許至少一個細胞發生分裂的條件下繁殖微生物(包 括大腸菌）的裝置(優選地，培養裝置包括用于降低或最小化偶發污染可能性的殼體和/或 支持微生物生長的營養物質源）；
[0039] "檢測"是指鑒定微生物(例如，祀大腸菌）的至少一種組分，由此確定微生物的存 在；
[0040] "遺傳檢測"是指對來自祀大腸菌的遺傳物質組分(如DNA或RNA)的鑒定；
[0041] "免疫檢測"是指對來自祀大腸菌的抗原物質(如蛋白質或蛋白多糖)的鑒定；
[0042] "微生物"是指具有適于分析或檢測的遺傳物質的任何細胞或粒子(包括(例如)細 菌、酵母、病毒和細菌內生抱子）；
[0043] "光學檢測"是指對通過培養裝置或培養基(包含至少一個微生物或微生物菌落） 透射的、吸收的、發射的、反射的、折射的、散射的、或者說是轉換的（優選地，至少部分透射 的）且用作至少一個大