一種木質纖維素高溫酶解發酵產丁醇的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物質能源領域，具體涉及一種木質纖維素高溫酶解與發酵產丁醇的方法。
【背景技術】
[0002]丁醇是一種重要的有機化工原料，在化工、醫藥和石油等工業部門有廣泛的用途。而且由于比乙醇多兩個亞甲基，丁醇具有更高的疏水性，較低的揮發性，可與汽油以任意比例混合，并具有與汽油相當的熱值。作為一種有潛力的可以替代汽油的可再生生物能源，丁醇越來越受到世界各國的關注。
[0003]隨著石油資源的日益枯竭，降低礦物能源的使用比重，加強可再生能源開發已成為人類今后能源利用的重要趨勢。而且采用以石油為原料的丙烯羰基合成法生產丁醇由于技術落后，裝置偏小導致產能不夠，致使中國丁醇市場長期供應不足，不能滿足國內市場的需求。生物發酵法制備丁醇有其獨到的優勢，發展生物丁醇將極大地緩解丁醇供應不足的現狀。
[0004]由于我國人口眾多，用傳統的原料(玉米和甘蔗)發酵生產丁醇勢必會造成與人爭糧的問題，造成糧食短缺，因此開展以可再生的生物質材料為原料生物轉化生產生物丁醇是符合國情的研究方向。木質纖維素類農業副產物，蘊含大量的纖維素和半纖維素，例如玉米秸桿干物質中纖維素占34-42%，半纖維素占22-28%(岳國君，纖維素丁醇工程概論[M].北京:化學工業出版社，2014)。纖維素的水解產物為葡萄糖，而半纖維素的水解產物主要為木糖，還有少量甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖，木質纖維素原料水解產生的混合糖中，半纖維素糖(主要為木糖)占30%-40%，因此半纖維素糖的發酵顯得至關重要。我國政府十分重視能源多元化和環境污染問題，采取財政補貼和稅收減免等鼓勵措施，大力推進多元化替代石油能源的技術和產業開發。《可再生能源法》和《國家中長期科學和技術發展規劃綱要》的出臺，極大地推進了生物柴油和燃料丁醇等生物液體燃料的開發進程。我國規劃到2020年，生物燃料消費量占到全部交通燃料的15%左右，建立起具有國際競爭力的生物燃料產業，這給我國燃料丁醇產業帶來了良好的發展機遇。
[0005]纖維素水解過程中纖維素酶的成本和丁醇分離能耗等一直是纖維丁醇工業化的制約因素。中國專利CN200910098877.8公開了一種纖維素酶產生菌及其制備和應用，該菌株具有耐高溫的能力，其分泌的纖維素酶具有耐高溫的特點。中國專利CN201110025776.5公開了一種高溫酸性纖維素酶EgG5及其基因和應用，該發明的纖維素酶具有以下性質:最適pH3.5?5.0，最適溫度70°C，比活為60.3U/mg;良好的穩定性，在極端酸性范圍內依然保持較高酶活。
[0006]傳統的纖維素酶工藝采用的纖維素酶較優化的酶解溫度為45_50°C，研究表明更高的溫度酶解可以提高酶解效率，減少纖維素酶的使用量，現有耐高溫纖維素酶可以用于高溫酶解制糖，然后發酵產丁醇，但耐溫纖維素酶產業還不成熟，遠未到工業化的程度。開發一種能夠使常規市售纖維素酶提高酶解溫度的方法對纖維素丁醇工業的發展具有重要意義。
【發明內容】
[0007]針對現有技術的不足，本發明提供了一種木質纖維素高溫酶解發酵產丁醇的方法。本發明方法可以提高酶的活性和利用率，增加發酵產物得率，可降低了酶解和發酵成本。
[0008]本發明木質纖維素高溫酶解與發酵產丁醇方法，包括如下內容:
(2)將預處理原料、纖維素酶、水和黃原膠加入到酶解罐中進行預酶解，控制酶解體系的干物質濃度為5wt%-15wt%;控制酶解時間為8-48h;預酶解的pH為4.5-5.5;預酶解的溫度為 54-62 °C;
(3)預酶解后料液打入到發酵罐中，加入丁醇發酵菌株進行同步糖化發酵；
(4)發酵液打入到精餾裝置分離丁醇，及丙酮和乙醇副產物。
[0009]步驟(I)中，木質纖維素原料優選為玉米秸桿;所述預處理方式優選采用稀酸蒸汽爆破組合預處理。
[0010]步驟(2)中，黃原膠加入量為0.02-0.20 g/L。
[0011 ] 步驟(2)中，控制酶解時間優選為12-24h；預酶解的pH優選為4.8-5.2；預酶解的溫度優選為56-60 °C。
[0012]步驟(2)中，所述的纖維素酶的加入量使得纖維素酶與預處理原料中纖維素的比例為5-25IU/g纖維素。
[0013]步驟(3)中，同步糖化發酵是指預酶解后殘余纖維素在發酵葡萄糖產丁醇的同時繼續被水解的過程。
[0014]步驟(3)中，所述的丁醇發酵菌種包括:丙酮丁醇羧菌ATCC824和拜氏羧菌NCIMB8052，培養溫度優選36-42°C;丁醇發酵菌種子液的接種量為I v%_5 v%，預酶解后加入氫氧化鈣調節PH為6-8，丁醇發酵菌種利用預處理和預酶解階段產生的自由糖生長，同時pH開始下降，最后穩定在4.5-5.0，進入到同步糖化發酵，控制發酵溫度為36-42°C，發酵時間為48-96h0
[0015]步驟(3)中，同步糖化發酵體系中加入氮源，氮源可選自酵母膏、蛋白胨、玉米漿、硫酸銨、酸解豆柏或尿素等中的一種或幾種，加入量為體系總質量的0.02 wt%-0.2 wt%0
[0016]步驟(3)中，氮源優選酸解豆柏。
[0017]與現有技術相比，本發明具有以下優點:
1、在酶解體系中加入黃原膠，提高纖維素酶的耐受高溫的能力，提高酶解的溫度，有利于提高纖維素酶的活性，降低纖維素酶的使用量，提高木質纖維素的酶解效率，提高經濟性。
[0018]2、利用丁醇發酵菌株的耐溫性和生長過程中pH變化特性，對預酶解后殘余的纖維素進行同步糖化發酵，可以降低葡萄糖對纖維素酶的反饋抑制，進一步提高纖維素的酶解效率，降低酶成本。
[0019]3、玉米秸桿預處理過程中可能產生一些對丁醇發酵菌種具有毒性的化合物，例如甲酸、乙酸、糠醛、羥甲基糠醛和酚類物質，利用氫氧化鈣調節pH還可起到水解液脫毒的作用。
【附圖說明】
[0020]圖1是本發明的工藝流程圖；
其中，1-酶解罐，2同步糖化發酵罐，3-產品分離單元。
【具體實施方式】
[0021]下面通過實施例對本發明方法作進一步說明。本發明中，wt%為質量分數，v%為體積分數。
[0022]實施例1
本發明實施例使用的木質纖維素原料為玉米干秸桿，其中纖維素38.2 wt%，半纖維素22.1 *丨％，木質素20.2 *丨％，灰分3.9 wt%，用粉碎機粉碎至顆粒大小為l_5mm。采用稀酸蒸汽爆破進行預處理，反應溫度為1900C，反應時間5min，固液比為1:2，稀硫酸濃度為2.0wt%。從蒸汽爆破裝置出來后用NaOH調節pH為5.0，其中干物質濃度為32wt%，干物質中纖維素含量為40 wt%，干物質中木糖含量20.8%，預處理干物質回收率為96 wt%0
[0023]種子液培養基為丁醇發酵菌種的常規培養基，如P2和RCM等，115°C滅菌30min備用。種子液的制備共分3級培養:第一級利用接種針從固體培養基中接入到置于10 mL厭氧管中的3 mL種子培養基中，37°C厭氧培養24 h;第二級培養從第一級培養液接種到I L發酵罐中的500 mL種子培養基中，37°C，100r/m，通入犯厭氧培養24h;第三級培養把第二級培養液全部接種到50 L發酵罐中的25 L種子培養基中，37 °C，100 r/min，通入N2厭氧培養24
ho
[0024]按圖1所示的流程，采用立式酶解罐的有效容積為240L，同步糖化發酵罐的有效容積為240 L。將預處理好的玉米秸桿、纖維素酶(購自諾維信生物技術有限公司，型號為Ctec2，濾紙酶活135 IU/g)和水按比例連續加入到酶解罐中進行預酶解，其中預處理玉米秸桿的加入量為75 kg，纖維素酶加入量0.48 kg加入后相當于6.75 I U/g纖維素)，黃原膠加入量0.036 kg，自來水加入量164.484 kg，酶解體系中干物質濃度為10 wt%，酶解罐中溫度為58°C，pH 5.0，攪拌速率50 r/min，預酶解時間為24 h。然后從酶解罐栗入到同步糖化發酵罐中，利用氫氧化鈣調節PH為7.5，之后連續通入仏除去培養基質中的氧氣，再接入ATCC824種子液24 L。氮源采用酸解豆柏，加入量0.24 kg，豆柏酸解方法為:0.24 kg豆柏加入到I L 2%的硫酸中，95°C酸解24 h。發酵罐中溫度為37°C，攪拌速率為100 r/min，N2在整個發酵過程中一直保持通入，通氣量為0.05 ￥糧<^了0:824生長過程中？!1從7.5下降，最后控制在4.5，同步糖化發酵時間為96 ho
[0025]通過液相色譜檢測，最終發酵液中產生的溶劑濃度為22.9g/L，其中丁醇濃度為
13.58/1，丙酮濃度7.1 8/1，乙醇濃度2.3 g/L。經過計算葡萄糖得率為94%，溶劑得率為33%。
[0026]比較例I
處理流程和工藝條件與實施例1相同，不同之處在于:酶解罐中不加入黃原膠，預酶解溫度為50 °C。
[0027]通過液相色譜檢測，最終發酵液中產生的溶劑濃度為20.6g/L，其中丁醇濃度為
11.58/1，丙酮濃度6.6 8/1，乙醇濃度2.5 g/L。經過計算葡萄糖得率為83%，溶劑得率為32%0
[0028]比較例2
處理流程和工藝條件與實施例1相同，不同之處在于:酶解罐中不加入黃原膠，預酶解溫度為58 °C。
[0029]通過液相色譜檢測，最終發酵液中產生的溶劑濃度為17.0g/L，其中丁醇濃度為
9.5g/L，丙酮濃度5.4 g/L，乙醇濃度2.1 g/L。經過計算葡萄糖得率為68%，溶劑得率為30%。
[0030]實施例2
本發明木質纖維素高溫酶解與發酵產丁醇方法，包括如下步驟: