PD-1基因重組病毒質粒及構建、重組逆轉錄病毒Lenti-PD-1-Puro及包裝與應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物技術及細胞治療的技術工程領域，具體設及一種PD-1基因重組病 毒質粒，命名為病毒質粒KGEN-0626,于2016年1月27日保藏于位于中國武漢武漢大學的中 國典型培養物保藏中屯、，保藏號為CCTCC N0:V201601，本發明還設及重組逆轉錄病毒 Lenti-PD-1-Puro的包裝及在利用該重組病毒對腫瘤細胞進行免疫治療中的應用。
【背景技術】
[0002] 癌癥已超過屯、臟疾病，成為全球第一大死亡原因。癌癥治療在過去幾十年中取得 了可喜的進展。腫瘤治療除了外科手術外，還包括化療、放療及祀向藥物治療。盡管運些方 法在一定程度上控制了癌癥的發展，但其缺乏特異性，會在殺死腫瘤細胞的同時殺死正常 細胞，此外運些藥物治療毒性大，嚴重損傷了正常免疫系統，影響病人的生存質量。
[0003] PD-UProgrammed Death 1)程序性死亡受體-1:是一種重要的免疫抑制分子。最 初是從小鼠 T細胞雜交瘤2B4.11克隆出來。PD-1抑制療法是通過解除腫瘤逃避免疫系統能 力的新型免疫治療方法。癌細胞逃避免疫殺傷的一種機制，是通過它的表面產生一種稱為 程序性死亡配體-l(PD-Ll).當運種PD-L1聯接到一類免疫細胞T細胞的PD-1蛋白上即引起T 細胞失活。T細胞就不能夠發現腫瘤向免疫系統發出攻擊腫瘤的信號。
[0004] 該免疫治療方法的設計思路是，針對腫瘤患者T細胞上的PD-1基因鎖定或基因敲 除，將使患者T細胞上的PD-1與腫瘤細胞表面的PD-L1不產生聯接，從而激活患者自身的T細 胞功能，達到殺死腫瘤細胞的目的。
[0005] 目前美國已經有抗PD-1藥物的臨床實驗，證明了運種機理治療癌癥成效顯著。 2014年施貴寶公司研制的化divo(PD-l抑制劑Nivolumab)先后在日本和美國上市，而默沙 東公司研制的Keyt;ruda(PD-l抑制劑化mboolizamab)則是第一個在美國上市的用于晚期 轉移皮膚黑色素瘤(Melanoma)的抑制劑，該PD-1抑制劑在運些皮膚黑色素瘤晚期轉移病人 的臨床實驗中，被發現持續性地抑制腫瘤，大大提高病人的存活時間和存活率(60%的病人 存活超過兩年）。更令人振奮的病例發生在紐約斯隆.凱特琳癌癥紀念研究中屯、(Memorial Sloan Kettering Cancer Center,MSK)的黑色素瘤病人的治療反應。一位患有轉移性黑色 素瘤的49歲女患者，左胸下有一巨大有蒂的壞死性腫瘤。在進行一個劑量的試驗性結合免 疫治療3周后，腫瘤消失了。此文發表在4月20號新英格蘭雜志（肥JM)上。與此同時，MSK的 化ul化曰9111曰11博±報道，其有效率達22%(74個病人中有16個治療后未再發現腫瘤存在）。
[0006] 另外，晚期非小細胞性肺癌(NSCLC)和肝癌化epatocellular Cancer)治療中亦取 得相當好的效果。在2015年第5屆美國臨床腫瘤年會(ASC0)中（5月29日至6月2日在美國芝 加哥召開），美國南加州大學Norris大學癌癥中屯、Anthony B.化-趾oueiry教授報導在一項 Ι/Π 期研究成果表明Nivolamab治療晚期肝癌是安全有效的。42名患者有8名患者（19%)月中 瘤縮小30 %，12個月總存活率為62 %，最長達17個月，而目前市場上最新藥物索拉菲尼（一 種FDA批準的晚期肝癌治療藥物-多祀點酪氨酸激酶抑制劑），客觀腫瘤緩解率只有2%的患 者有效，總生存率為10-11個月。施貴寶公司亦公布了化divo(Nivolumab)的試驗數據，在對 582位患者臨床試驗中，使用標準化療法，四期肺癌患者生存期為9.4個月，而使用 Nivolumab藥物治療，患者平均生存期提高到12.2個月，有的甚至到19.4個月。是常規標準 化療的近2倍。另外，默沙東的Key truda (Pemboo 1 i zumab)是美國首個獲批的抗PD-1藥物，用 于惡性黑色素瘤及非小細胞性肺癌。另外在臨床試驗中，對胃癌(Gas化ic Cancer)的有效 率達53%的患者腫瘤縮小。食管癌化sophageal Cancer)患者52 %腫瘤縮小，頭頸部腫瘤 巧ead and Neck &nce;r)57%的腫瘤縮小。
[0007] 綜上所述，PD-1抗體藥物治療腫瘤療效顯著。然而目前國內尚無 PD-1抗體，PD-1抗 體治療藥物仍在研發之中，尚未進入臨床試驗。另外，PD-1抗體制備及純化過程復雜，周期 長，制造成本高，造成抗體藥物昂貴，事實上普通百姓是難于承受運種高昂的治療費用。
[0008] 有鑒于此，我們發明了一個PD-1重組病毒的制備方法，并利用此重組病毒進行腫 瘤的免疫細胞治療。
【發明內容】
[0009] 本發明通過構建PD-1重組病毒質粒，并通過包裝得到重組逆轉錄病毒Lenti-PD- 1-Puro,同時利用此重組病毒經體外感染T細胞從而敲除T細胞上PD-1受體，從而使此種基 因修飾后的T細胞恢復在人體內攻擊腫瘤細胞的能力，達到免疫細胞治療的作用。
[0010] 本發明提供了一種PD-1基因重組病毒質粒，屬逆轉錄病毒質粒，命名為病毒質粒 KGEN-0626，于2016年1月27日保藏于中國典型培養物保藏中屯、，保藏號為CCTCC NO : V201601，其序列為沈Q ID N0:1。
[0011] 本發明還提供了上述所述PD-1基因重組病毒質粒的構建，其是通過選擇PD-1基因 序列中2859-2878共20個堿基序列即CACGAAGCTCTCCGATGTGT作為PD-1特異性引導RNA即 gRNA，并在T4連接酶的作用下與其互補鏈ACACATCGGAGAGCTTCGTG結合形成雙鏈互補DNA，最 后將此雙鏈DNA克隆進病毒質粒Lenti-CRISPR/Cas9-Puro即得到重組PD-1病毒質粒Lenti- CRISPR/Cas9-PD-1-Puro。
[0012] 上述所述PD-1基因重組病毒質粒的構建，其具體包括下述步驟：
[0013] 1)使用EcoRl和Age 1核酸內切酶和憐酸酶37 °C處理30分鐘去憐酸化Lent i- CRISPR/Cas9 質粒；
[0014] 2) WPD-1基因序列中2859-2878位的共20個堿基序列作為PD-1特異性引導RNA也 良PPD-lgRNA，在T4連接酶的作用下將PD-lgRNA引物序列與其互補的鏈經37°C解育30分鐘， 95°C解育5分鐘，再W每分鐘5°C的速度降溫至25°C的條件退火合成PD-1雙鏈DNA;
[001引 3)使用快速核酸連接酶將PD-1雙鏈DNA與Lenti-CRISPR/Cas9-Puro質粒連接，室 溫解育10分鐘即可得到重組病毒質粒Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro。
[0016] 本發明還提供了一種重組逆轉錄病毒Lenti-PD-1-Puro,其包含有PD-1基因重組 病毒質粒 Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro。
[0017] 上述所述重組逆轉錄病毒Lenti-PD-1-Puro的包裝，包括下述步驟：
[0018] 1)將重組病毒質粒Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro轉入Stbl3細菌，經氨節青霉素 篩選，擴增，純化，測序；
[0019] 2)轉染前一天種293T細胞到10cm培養皿，細胞密度W第二天長到細胞80%匯合為 宜;培養基為DMEM，其中含10%胎牛血清、5000U的抗生素;抗生素可W為氨節青霉素和/或 鏈霉素；
[0020] 3)轉染前2小時換新鮮培養基，將PD-1重組病毒質粒Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1- 化ro與質粒pSPAX、pMD2.G轉染試劑混合到1.5ml離屯、管中；
[0021] 4)將混合液輕輕混勻后室溫放置10分鐘后加入10ml細胞培養基中，輕搖混勻；
[0022] 5)37°C，5%C02細胞培養箱培養6小時后，更換新鮮培養基；
[0023] 6)培養48小時后收集富含病毒的培養基，用0.45um的濾器過濾后分裝保存于-80 度，或直接用于感染T細胞。
[0024] 上述步驟中所述培養基均指DMEM培養基，其中含10%胎牛血清、5000U的抗生素， 抗生素可W為氨節青霉素和/或鏈霉素；
[0025] 本發明還提供了該重組逆轉錄病毒Lenti-PD-1-Puro在制備用于治療腫瘤細胞的 免疫系統中的應用。
[0026] 本發明是通過將PD-1基因的一段特異性引導RNA(gRNA)序列克隆進逆轉錄病毒質 粒Lenti-CRISPR/Cas9-化ro中，從而得到PD-1 重組病毒質粒Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1- Puro,再將此病毒質粒與另外兩種逆轉錄病毒輔助質粒pSPAX及PMD2.G共同轉染293T細胞 后，最后包裝成重組病毒Lentivirus PD-1-化roiXenti-PD-1-化ro)。此PD-1重組病毒感染 T細胞后可在化s9的作用下切割PD-1基因從而敲除T細胞上的PD-1，解除腫瘤患者T細胞的 抑制狀態并使其激活攻擊腫瘤細胞。
[0027] 目前與本發明最接近的現有技術是在歐美及日本等國開展的PD-1抗體治療腫瘤 技術。該抗體治療技術存在W下幾點明顯不足之處:第一，很多正常的組織及細胞亦表達少 量的PD-1配體，PD-L1或PD-L2,因此PD-1抗體也會結合到運些組織和細胞的配體而產生一 些不同程度的副作用；第二，由于PD-1抗體不是僅僅針對腫瘤細胞表面的PD-L1或PD-L2配 體(其他組織也表達該配體），因此不可避免的降低抗體治療的特異性;第Ξ，抗體制備及純 化過程復雜，制造成本高，治療費用昂貴，且療程長。有的病人需要半年甚至一年W上的療 程。造成病人沉重的的經濟負擔。相較于PD-1抗體治療，本發明具有明顯的如下優點：
[0028] 1.本發明使用的免疫細胞治療特異性強，我們使用的技術是特異性敲除T細胞上 的PD-1基因，阻礙其與腫瘤細胞表面PD-L1或PD-L2配體的結合，從而解除T細胞被抑制的狀 態，達到激活T細胞殺滅腫瘤細胞的目的；
[0029] 2.本發明使用患者自身的T細胞在體外敲除PD-1基因，運些T細胞是病人自身的免 疫細胞，無免疫排斥作用，細胞來源方便，易在體外培養擴增；
[0030] 3.本發明方法采用的自身的T細胞，相較于抗體治療費用低，具有安全性、針對性、 持久性、全身性及徹底性。
【附圖說明】
[0031 ] 圖1為PD-1基因重組病毒(Xentil-PD-1-Puro)質粒結構示意；
[0032] 圖2為利用PD-1基因重組病毒體外治療肝癌細胞的應用結果圖（應用前后T細胞流 氏鑒定的結果）；腫瘤患者（肝癌志愿者）外周血T細胞，pd-1基因敲除效率（K0 efficien 巧）：CD3:35.2%;CD4:26.5%;CD8:47.1%;
[0033] 圖3為利用PD-1基因重組病毒體