編碼甘薯erf轉錄因子的基因及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程領域，具體設及一種編碼甘馨ERF轉錄因子的基因，該基因編 碼的蛋白質W及含有該基因的重組載體及基因的應用。
【背景技術】
[0002] 在植物中許多基因都受逆境脅迫誘導表達，根據作用方式的不同，主要分為兩大 類：調芐基因和功能基因。調芐基因主要是在信號轉導和基因表達中起調節作用的轉錄因 子;功能基因主要編碼一些調節滲透勢、清除自由基和活性氧的酶等。一般認為，植物對干 旱和高鹽等逆境的抗性受多基因控制，因此，利用基因工程技術導入單個功能基因雖然能 增加植物的某種單一抗性，但并不能從整體上綜合提高植物的抗逆性。轉錄因子作為功能 基因表達的調節開關，可W對不同的基因進行精確的調節，在植物逆境信號傳遞過程中發 揮著關鍵的作用，所W通過增強某個轉錄因子的作用，可促使多個與抗逆有關的功能基因 表達，運是使植物抗逆性狀獲得綜合改良的一條非常有效的途徑。
[0003] 植物AP2/ERF是一個龐大的轉錄因子基因家族，含有由60~70個氨基酸組成的 AP2/ERF結構域而得名，存在于所有的植物中。AP2/ERF轉錄因子參與多種生物學過程，包括 植物生長、花發育、果實發育、種子發育、損傷、病菌防御、高鹽、干旱等環境脅迫響應等。 AP2/ERF類轉錄因子參與水楊酸、萊莉酸、乙締、脫落酸等多種信號轉導途徑，而且是逆境信 號交叉途徑中的連接因子。根據含AP2/ERF結構域的數目，AP2/ERF轉錄因子含5個亞組，包 括AP2(APETALA 2)、RAV(related to ABI3/VPl)、DREB(dehyclration-responsive element binding protein)、ERF和其他。AP2家族含2個AP2/EREBP(ethylene-responsive element binding protein)結構域，ERF和DREB家族僅含1個AP2/EREBP結構域，而RAV家族除一個 AP2/EREBP結構域外還含1個B3結構域。ERF家族是AP2/ERF轉錄因子大家族的一個主要亞家 族，在調節植物生物和非生物逆境反應中發揮重要作用。在擬南芥和水稻基因組中分別含 有122和139個ERF轉錄因子家族成員，根據基因序列系統樹和蛋白保守結構域等特征，擬南 芥和水稻ERF基因分別組成12和15個不同的組。
[0004] 甘馨不僅是重要的糧食作物，而且還是重要的經濟作物和能源作物。甘馨廣泛種 植在世界上的100多個國家，我國是世界上的最大生產國，甘馨生產約占世界甘馨的80%。 與其他糧食作物相比，甘馨相對較為耐旱，但品種間差異較大，世界上相當比例的甘馨種植 在干旱的環境下，而世界干旱、半干旱地區已占陸地面積的Ξ分之一 W上，干旱對植物的影 響在諸多自然逆境因素中居首位。我國現有邊際性±地資源(非耕地)約20億畝，主要是干 旱、鹽堿灘涂地。在我國農業用水緊缺、耕地面積緊張的形勢下，在運些地區開發種植耐旱 甘馨，既能合理的利用±地資源，又能部分緩解糧食和能源緊缺問題。通過定向改良甘馨的 抗逆境能力，提高甘馨在邊際性±地區的生長適應性，對確保我國的糧食安全具有重要的 戰略意義。因此在甘馨中克隆新的ERF類轉錄因子基因，研究其基本的生物學特性和功能， 可為整個植物抗逆基因調控網絡及脅迫應答反應機理提供理論基礎，并為改良作物抗逆性 提供一定的物質基礎。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的之一在于提供一種編碼甘馨ERF轉錄因子的基因，該基因命名為 IbRAP2.4〇
[0006] 本發明的第二個目的是提供一種該基因編碼的蛋白質。
[0007] 本發明的第Ξ個目的是提供一種含有該基因的表達載體。
[0008] 本發明的第四個目的是提供一種含有該表達載體的宿主細胞。
[0009] 本發明的最后一個目的在于提供該基因的用途。
[0010] 本發明的技術方案概述如下：
[0011] -種編碼甘馨ERF轉錄因子的IbRAP2.4基因，它是SEQ ID N0.1所示的核巧酸序 列。所述的核巧酸序列由885個堿基組成。
[0012] 所述IbRAP2.4基因具有調控植物根系發育，增強生物量W及抗旱性的功能。
[0013] 上述基因編碼的蛋白質，它是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。所述的序列由294 個氨基酸殘基組成。
[0014] 一種含有上述基因的表達載體pCAMBIA1305-IbRAP2.4,它含有SEQ ID N0.1所示 的核巧酸序列。
[0015] 一種含有上述表達載體農桿菌宿主細胞EHA105: PCAMBIA1305-2 X 35s-化RAP2.4 的構建。
[0016] 上述基因在轉化植物獲得轉基因植株中的應用，尤其是在制備轉基因擬南芥中的 應用。本發明的優點：
[0017] 本發明從甘馨中分離出編碼邸F轉錄因子基因的完整cDNA，連接到植物表達載體 上，利用農桿菌侵染法轉化植物，獲得轉基因植株，對轉基因植株進行了抗逆性分析，結果 表明IbRAP2.4基因能夠增強植物的根系發育和生物量，并且響應逆境信號，正向調控植物 的耐旱能力。此基因可W應用于植物遺傳改良。
【附圖說明】
[0018] 圖1.扣RAP2.4氨基酸序列的系統進化樹分析結果 [0019] 圖2.扣RAP2.4在甘馨不同組織中的表達
[0020] 圖3.干旱脅迫誘導表達后扣RAP2.4的表達
[0021] 圖4. PCAMBIA1305-2 X 35s-扣 RAP2.4 載體示意圖
[0022] 圖5.過表達IbRAP2.4基因對擬南芥植株葉片大寫、生物量的影響
[0023] 圖6.過表達IbRAP2.4基因對擬南芥根發育的影響
[0024] 圖7.未轉化的野生型擬南芥株系和轉扣RAP2.4基因株系的根系比較
[0025] 圖8.未轉化的野生型擬南芥株系和轉IbRAP2.4基因株系的抗旱性比較
【具體實施方式】
[0026] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但下述實施例中所設及的具體實驗方法如無特殊說明，均為常規方法或按照制 造廠商說明書建議的條件實施。
[0027]實施例1
[002引甘馨中ERF轉錄因子扣RAP2.4基因序列獲得，具體如下：
[0029] 利用OMEGA RNA試劑盒，從lOOmg的新鮮的甘馨葉片中提取總RNA，利用反轉錄試劑 盒(Bioteke)合成 cDNA。
[0030] 具體反應體系如下： Total RNA 0.2-2ug Oiigo dT(50 uM) lul dNTP mixture(10mM 巧Ch| lul
[0031 ] 5x鬥rst Strand buffer 4ul M-MLV Reverse Transcriptase {200U/ul) lul Rnase Inhibitor (40U/ul) lul Rnase Free dH20 up 化 20'ul
[0032] 在PCR儀上按W下條件進行反轉錄反應：1、50°C，45min;2、70°C，lOmin;之后冰上 冷卻。
[0033] 將提取的總RNA送華大基因 （Beijing Genomic Insti1:ute,BGI)，通過高通量測序 獲得甘馨轉錄組數據庫，并通過De novo拼接獲得甘馨化igene數據庫，其中化igene23081 與NR數據庫比對后發現該基因可能參與逆境響應。將Unigene23081通過0FR FINDER 化ttp://www.ncbi .nlm.nih.gov/p;rojects/go;rf/)在線軟件預測基因完成的ORF，并利用 Primer Premier 5設計擴增完整0RF引物：
[0034] IbRAP2.4(F):5，ATGACCCGCCCGAACCT 3'
[0035] 扣RAP2.4(R):5 'CTTTGATCCCTTTCTGCAAATC 3 '
[0036] 利用TAKARA公司Primerstar GXL DNA聚合酶進行擴增，具體步驟如下： 5χ PnmeSTAR GXL Buffer lOul dIMTP Mixture (2.5 mM each ) 4ul lbRAP2.4 ( F) 10~15 pmo! 之ul
[0037] lbP.AP2.4 (R) 10~15 pmol 2u| Template 2uj PrimeSTAR GXL DNA Polymerase lul 滅菌蒸饋水 叩teiSOul
[003引 反應條件如下：94°C，4min;98°C，10Sec;55°C，15Sec;68°C，1.5min;72°C，10min; 30個循環。使用OMEGA DNA純化試劑盒將PCR產物純化，純化后的PCR產物與pEASY-Blunt載 體連接（本過程使用hansGEN的祀ASY-Blunt Vector Cloning Kit試劑盒），反應體系如 下：化RAP2.4基因的cDNA片段4ul，祀ASY-Blunt載體化L。反應條件：20-30°C，30min。連接產 物轉化 E-Coli.DH5a 感受態，涂布在含有 40ul 25mg/ml 的 X-Gal、16ul 50mg/ml 的 IPTG、 1 OOmg/mL Amp的LB瓊脂平板培養基上培養，形成單菌落。挑選白色菌落，使用菌落PCR法確 認祀ASY-Blunt載體中插入片段的長度大小，與預期一致。送南京金斯瑞生物科技公司測序 獲得基因序列沈Q ID NO. 1。
[0039] 實施例2
[0040] IbRAP2.4蛋白序列同源分析，具體如下：
[0041 ] 測序獲得。0魁全長90769,03。為68469，編碼227個氨基酸沈