OsTPPC基因在調控水稻籽粒總磷和植酸含量中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及植物基因工程技術領域，尤其設及一種OsTPPC基因在調控水稻巧粒總 憐和植酸含量中的應用。
【背景技術】
[0002] 水稻是世界最主要的糧食作物之一，特別是在亞洲地區約有一半W上的人口 W大 米為主食。而稻米消費國居民普遍存在鐵、鋒等微量營養元素缺乏癥，尤其我國既是世界大 米生產及消費的主要國家，又是世界上鐵缺乏和缺鐵性貧血發生較嚴重的國家之一。
[0003] 稻米中的憐(P)素主要W植酸鹽的形式存在，由于人和單胃動物(雞、豬、魚等)體 內不含降解植酸鹽的植酸酶基因，不僅導致食物中的植酸鹽無法被人體吸收利用，同時植 酸鹽進入人體后還會進一步和其他來源的鐵、鋒等金屬微量營養元素絡合，降低其生物有 效性。
[0004] 此外，包含米皮、糊粉層和米胚的米教是重要的動物飼料，但是單胃動物與人一樣 無法利用食物中植酸鹽(憐素和金屬微量元素），而其它類動物食用后也因所含憐素含量超 過需要，運些不能利用的憐素最終排放到環境中去造成嚴重污染。因此，國際上一直試圖培 育總憐和植酸含量都顯著降低的農作物品種，W提高其營養價值和環境友好性能(Raboy V.2009.Approaches and challenges to engineering seed phytate and total phosphorus.Plant Science 177:281-296)。
[0005] 迄今已在大麥中發現了低總憐和低植酸含量的突變體（Raboy V，Cichy K， Peterson Κ,Reichman S,Sompong U,Srinives P,Saneoka H.2014.Barley(Hordeum vulgare L.)Low Phytic Acid 1-1:an endosperm-specific,filial determinant of seed total 地os地orus.Journal of Heredityl05:656-665.)，但迄今尚未在植物中發現 控制運一"雙低"特性的基因，從而也還沒有一種生產雙低巧粒的可靠方法。
【發明內容】
[0006] 本發明提供了一種OsTPPC基因在調控水稻巧粒總憐和植酸含量中的應用，該 OsTPPC基因中堿基的缺失會降低水稻巧粒中總憐的含量和植酸的含量，用于選育低總憐和 低植酸的水稻品種。
[0007] 本發明發現了 OsTPPC基因在調控水稻巧粒總憐含量中的應用，所述OsTPPC基因的 核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[000引本發明還發現了OsTPPC基因在調控水稻巧粒植酸含量中的應用，所述OsTPPC基因 的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 上述OsTPPC基因在GenBank中的號碼為KT188441，0sTPPC基因編碼的蛋白質的氨 基酸序列如SEQ ID ^.2所示，在66誠曰證中的號碼為1〇'188445;03了??(：基因編碼區的序列 如沈Q ID NO.3所示。
[0010] 本發明還提供了一種低總憐且低植酸水稻的培育方法，包括：
[0011] (1)構建OsTPPC基因的RNAi發夾結構單元；
[0012] (2)將所述發夾結構單元連入中間載體，構建植物表達載體；
[0013] (3)將所述植物表達載體通過農桿菌介導轉化水稻愈傷組織；
[0014] (4)將水稻愈傷組織轉移到選擇性培養基上繼續培養，待分化成苗，移栽大田，篩 選獲得低總憐且低植酸水稻植株；
[0015] 所述OsTPPC基因的核巧酸序列如沈Q ID NO. 1所示。
[0016] 上文所述的RNAi發夾結構單元是指中間為內含子、兩端的目的基因片段反向互補 形成的一種"目的基因片段-內含子-目的基因片段(反向r形式的發夾結構;其中目的基因 片段為OsTPPC基因的CDS序列，序列如SEQ ID NO.3所示;而內含子無嚴格要求，本發明中內 含子來自地551(-抑載體，堿基序列如56〇10^.8所示。
[0017] 具體地，所述植物表達載體為pCAMBIA 1301-35SN。所述農桿菌為EHA105。所述水 稻的品種為日本晴。
[0018] 本發明還提供了一種低總憐且低植酸水稻的培育方法，包括：
[0019] (1) W含有OsTPPC基因的水稻植株為母本，突變體MH86-lpa為父本，進行雜交，獲 得Fi代；
[0020] (2)Fi代自交后，獲得F2代；
[0021] (3)對F2代幼苗進行PCR基因檢測，從F2代中挑選出僅具有178bp特征帶的單株，獲 得低總憐且低植酸的水稻。
[0022] 其中，所述母本為嘉禾218。
[0023] 本發明通過兩個水稻突變體低總憐、低植酸的巧粒表型，采用圖位克隆技術克隆 獲得調控水稻巧粒總憐和植酸含量的OsTPPC基因，并通過遺傳互補轉化、RNA干擾等技術， 驗證了 OsTPPC基因在調控水稻巧粒總憐和植酸含量中的作用。
【附圖說明】
[0024] 圖1為控制Μ冊6-lpa和Z9B-lpa低總憐、低植酸特性的基因定位與克隆圖；
[002引 （a)MH86-lpa突變基因初步定位在水稻4號染色體，與SSR分子標記RM5478和 RM17567連鎖；
[0026] (b)M冊6-lpa突變基因精細定位在分子標記ID2和C1之間的11化b區域內；
[0027] (C)候選區域內包含14個預測基因；
[002引 （d)OsTPPC基因結構及突變位點示意圖，其中MH86-lpa在L0C_0s04^5800的第12 個外顯子出現一個堿基缺失(+1828) ;Z9B-lpa在第1個外顯子缺失6個堿基(+297-303);
[0029] (e )0sTPPC蛋白結構域及其突變效應，其中MH86-lpa中密碼子翻譯提前終止，產生 一個截短的蛋白；Z9B-lpa則缺失2個氨基酸；
[0030] 圖2為OsTPPC基因功能互補材料的植酸憐離子色譜檢測峰圖；
[0031] (a)M冊6野生型；（b)M冊6-lpa突變體；（c)M冊6-lpa互補轉基因植株；（d)M冊6-lpa 轉基因互補材料的非互補姐妹系。
[0032] 圖3為實施例3中分子標記輔助選擇電泳圖，即：MH86-lpa、嘉禾218及它們的F2分 離后代的凝膠電泳基因分型圖；
[00削 Μ: DNA分子量標準；1、2和3分別代表野生型、突變體及雜交Fi代植株樣本;4-18為F2 雜交分離后代。
【具體實施方式】
[0034] 下面結合【具體實施方式】對本發明做進一步地說明。
[0035] W下實施例所使用的分子生物學和生物化學方法均為已知的技術，W下實施例中 所用的實驗材料如無特殊說明均為市售購買產品。
[0036] 實施例lOsTPPC基因功能的發現
[0037] 水稻突變體Μ冊6-lpa和Z9B-lpa分別由釉稻品種明恢86(M冊6)和。中9B"通過丫射 線誘變獲得化iu QL,Xu XH,Ren XL,化 HW，Wu DX,化U QY.2007.Generation and characterization of low phytic acid germplasm in rice(oryza sativa L.) ?Theoretical and Appiedl Genetics 114:803-814)。
[0038] 經實驗，我們發現運兩份水稻突變體M冊6-lpa和Z9B-lpa，在多年多點不同環境條 件下種植，它們巧粒中的總憐和植酸含量均極顯著低于其相應野生型親本明恢86(M冊6)和 中9B(Z9B)，即表現為低總憐、低植酸的巧粒表型，結果如表1所示。
[0039] 表1水稻突變體及其野生型親本糖米中的總憐和植酸憐含量
[0040]
[0041] 1數值為平均值±標準差(n = 3).**和*分別表示突變體的值與其相應的野生型存 在極顯著(P<0.01)和顯著差異(P<〇.〇5)。
[0042] 采用圖位克隆技術鑒定控制上述水稻低總憐、低植酸的基因，經鑒定，其在水稻功 能基因組中的基因號為L0C_0s04^5800,注釋為一個可能編碼硫酸鹽轉運基因家族3的基 因 OsTPPC。上述鑒定過程的具體內容如下：
[00創 Μ冊6-lpa材料與正常表型梗稻品種日本晴進行雜交，Fi代自交，得到F2群體，在分 葉盛期每個單株標記并取1克左右的嫩葉，然后單株收獲F2:3種子;采用Zhao等方法檢測水 稻種子的憐相關元素含量(Zhao町，Cui皿，Xu XHJan YY，Ri JJ，Liu GZ,化irier Y，Shu QY.2013. Characterization of osmik in a rice mutant with reduced phytate content reveals 曰n insertion of 曰 rearranged retrotr曰nsposon.Theoretical 曰nd Appiedl Genetics 126:3009-3020)。
[0044] 從中選出1181株具有低總憐與低植酸突變表型的個體作為定位材料，找出對應的 編號葉片，采用常規CTAB法提取總DNA;采用BSA法結合已公布的350對水稻SSR分子標記初 步定位在水稻第4號染色體長臂上的RM5478和RM17567分子標記之間（圖la)。
[0045] 根據已經公布的梗稻日本晴與釉稻9311的水稻基因組測序信息，我們進一步設計 開發了新的分子標記，最終將OsTPPC基因精確定位于BAC號為AL606690區段上11化b的范圍 之內，兩邊的分子標記分別為ID2和C2,并且與分子標記C1共分離（圖化）。
[0046] 對該區域內14個生物信息學預測的基因，在Μ冊6-lpa突變體和野生型Μ冊6中分別 逐一擴增測序比對分析，MH86-lpa和Z9B-lpa在基因 L0C_0s04^5800中存在等位突變，前者 在L0C_0s04^5800上存在一個化P的缺失，造成終止密碼子提前出現進而導致編碼蛋白變 短;后者存在一個化P的缺失，造成其編碼的蛋白缺失2個氨基酸(圖Id，e)。
[0047] 實施例20STPPC基因功能互補實驗
[004引為確定上述水稻巧粒中的低總憐、低植酸特性缺失由L0C_0s04^5800突變