基于乳液pcr的大片段單分子簇擴增技術的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物化學領域，具體的，設及一種基于乳液PCR的大片段單分子簇擴增 技術。
【背景技術】
[0002] PCR技術是通過酶促反應體外合成DNA片段的方法，能夠迅速獲得所需片段，具有 操作簡便、靈敏度高、特異性強等特點。PCR技術已經被應用于多個領域，如基因表達分析、 核酸序列分析W及當前的疾病診斷等。在PCR技術基礎上衍生出各種分支技術，乳液PCR技 術就是其中之一，乳液PCR主要是通過將PCR反應所有成分注入快速旋轉的油相表面，從而 在一個反應體系中形成數目龐大的微反應器，使得每個微反應器中有少量的模板，從而減 少模板間、引物間的相互干擾，最大化試劑的利用率，提高PCR反應的特異性。其應用領域也 是相當廣泛，包括可W輔助形成高通量測序過程中的單分子簇、使多重PCR中每種PCR產物 相對均衡等。雖然該技術的優勢明顯、應用廣泛，但由于其僅適用于較短的擴增長度，所W 限制了其在更多方面的應用。雖然目前用于長片段擴增的DNA聚合酶已經很多，擴增的最長 片段達到幾十肺P，但是實際擴增過程中的情況卻是常常難W獲得理想的擴增效果，得到的 擴增條帶也經常有非特異帶甚至彌散帶，所W不能滿足大片段擴增的需求。
[0003] 因此有必要對乳液PCR技術進行優化，增加乳液PCR技術的擴增長度，擴展乳液PCR 的應用范圍，從而為進一步拓展乳液PCR技術的應用領域提供有效手段。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于解決現有的乳液PCR技術所存在的難W擴增獲得特異性長片段 的缺陷，發明一種新的大片段單分子簇擴增方法。
[0005] 為此，本發明提供了一種基于乳液PCR技術的大片段單分子簇擴增方法，所述方法 包括:將攜帶有生物素標記的PCR引物與磁珠進行結合解育，使引物吸附于磁珠表面形成引 物簇，利用所述引物簇進行乳液PCR反應。
[0006] 本發明中對于PCR引物進行生物素標記的方法沒有特別的限制，可W利用本領域 常規的標記方法進行。
[0007] 可選的，所述磁珠為T1磁珠或M270磁珠。
[000引在本發明的一種優選的實施方式中，所述PCR引物的核巧酸序列如SEQ ID NO.3所 /J、- 0
[0009] 可選的，結合解育的體系為： 磁珠 lOOug 2 X磁珠結合緩沖液 25ul
[0010] 攜帶有生物素標記的PC民引物 5-10 umol ddH.O 加水至總體系為50ul。
[0011] 可選的，所述結合解育的條件為將所述攜帶有生物素標記的PCR引物與磁珠在20- 25°C解育5-20min。清洗磁珠4-5次，清洗的方法為用1 XBeads Wash Buffer清洗兩次， d地2〇洗2-3次。
[0012] 在本發明所提供的方法中，乳液PCR反應體系由預先各自配制好的水相和油相混 合制成。在所述乳液PCR反應體系中，包括引物簇W及游離引物，所述游離引物不帶有生物 素標記，游離引物的核巧酸序列與引物簇中磁珠上所吸附的PCR引物相同。游離引物的作用 為增加微反應體系中單分子模板的數量，模板數量的增多會增大模板與磁珠上引物的碰撞 幾率，使得擴增反應更容易發生。
[0013] 可選的，乳液PCR反應體系的水相包括： 2 X PC反緩沖液 25ul
[0014] dNTPs 04mM 每種 DNA 聚合酶 0.5-lU/50ui 引物簇 50-K)0ug
[001引游離PC民剖物 0.15-OJuM每棘 模板 DNA 0.1-200ng^0ul ddHsO 蛋水猶體系慧量為彿ul。
[0016] 在本發明所提供的方法中，所述游離PCR引物為未經過生物素標記的PCR引物。
[0017] 本發明所提供的方法還包括預先對基因組DNA進行破碎獲得5-8肺P的大片段，利 用所述大片段進行文庫構建獲得大片段文庫作為模板DNA。
[0018] 本發明中，對于文庫構建的方式沒特別的限制，可W按照本領域常規的方法進行 構建。
[0019] 在本發明的一種優選的實施方式中，可W按照W下步驟構建大片段文庫:將超聲 破碎后的大片段用AMPure beads進行純化，試劑盒進行大片段文庫構建，經過末端修復加 A 尾后，加接頭，接頭序列優選如SEQ ID NO. 1-2所示。用0.6%瓊脂糖凝膠電泳分離核酸片 段，切取4肺P、5肺P或6肺P附近的片段，用試劑盒回收目的片段獲得大片段文庫。
[0020] 可選的，乳液PCR反應的條件包括:94°C預變性Imin; 98 °C變性lOsec，68 °C退火延 伸4min，15-25個循環;72°C延伸5min;可根據實際需求選擇具體循環數。
[0021] 優選的，為了獲得更好的擴增效果，增加產物量、減少非特異性帶和彌散帶的產 生，在擴增過程中，升溫速度為1.0-1.5°C/s，降溫速度為1.5-2.4°C/s。
[0022] 特別優選的，升溫速率為1 .(TC/S，降溫速率為1.5°C/S。
[0023] 可選的，乳液PCR反應所使用的DM聚合酶為ΚΑΡΑ、肥B或K0D。
[0024] 可選的，為了獲得更好的擴增效果，減少非特異性帶和彌散帶的產生，乳液PCR反 應所使用的DNA聚合酶為K0D。
[0025] 可選的，在每lOOul PCR反應體系的水相中加入321.6ul油，滿旋震蕩形成乳液PCR 體系;滿旋混勻儀最大轉速震蕩5-7分鐘，每50ul-管進行PCR反應。
[00%] 可選的，利用超聲破碎的方式對基因組DNA進行破碎，超聲破碎的條件包括:在20- 4化赫茲下超聲破碎10-30S。
[0027]可選的，所述方法還包括利用與乳液PCR反應體系等體積的二下醇或異丙醇進行 破乳，破乳的條件為W1000-5000轉/分鐘的速度離屯、4-6分鐘，回收磁珠。
[00%]本發明中，油相可W按照W下方式進行配制:使用life science公司的油相，按照 Stabilizer l:Stabilizer 2:Mineral oil = 75:4:920或9:2:189的比例進行油相配制。
[0029] 本發明利用長片段核酸擴增酶，結合乳液PCR技術，制備單分子大片段簇，可W保 證一個磁珠上攜帶多個同樣的大分子，在用于基因組文庫構建時能夠確保同樣index對應 的大片段在打斷后有overlap,確保大片段的有效組裝，從而協助基因組組裝。目前已成功 達到4-6Kbp，并且二次PCR檢測主帶清晰，可W作為基因組文庫構建新技術的儲備技術。
【附圖說明】
[0030] 圖1為本發明實施例1的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中Μ為1Kb marker，1為二次PCR結 果。
[0031] 圖2為本發明實施例2的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中左邊起第一條泳道為1Kb marker，第二和Ξ泳道分別為W〇. 25ug和0.加 g磁珠為模板的二次PCR結果。
【具體實施方式】
[0032] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行詳細說明。
[0033] W下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0034] 實施例1
[0035] 1、大片段核酸文庫的制備
[0036] 取lug水稻基因組DNA，進行大片段核酸文庫制備：
[0037] (1)水稻基因組DNA經10s超聲破碎，獲得5-8Kbp的大片段，用AM化re XP Beads (邸CMAN，A63880)純化；純化后的樣品加入VAHTS Turbo End Prep En巧me Mix和VAHTS Turbo End Prep Reaction Buffer,混勻后20°C反應30min、65°C反應30min;
[0038] (2)反應結束后加入 VAHTS Turbo T4 DNA Ligase、VAHTS Turbo Ligase Enhancer、加入接頭，混勻后20 °C反應15min，磁珠純化；
[0039] 接頭序列如沈Q ID NO. 1-2所示。
[0040] 沈Q ID NO.1:5'-TGAGTGCCTTCTGCGTCCAGTCT-3';
[0041] 沈Q ID N0.2:5'-P03-GACTGGACGCAGAAGGCACTCA-3\
[0042] (3)純化后的樣品，經0.6%瓊脂糖凝膠進行片段分離，切取5肺p下邊緣至服bp下 邊緣的膠塊，回收DNA片段。
[0043] (4)檢測大片段文庫如bit濃度為1.44ng/ul。
[0044] 2、引物簇制備
[0045] (1)取M270磁珠，與含生物素標記的引物解育，形成引物簇，體系如下： 磁珠 lOOug; 2 X磁珠結合緩沖液 25ul;
[0046] 攜帶有生