基于磁珠法的高效血漿細胞游離dna提取方法

基于磁珠法的高效血漿細胞游離dna提取方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種基于磁珠法的高效血漿細胞游離DNA的提取方法，屬于生物技術 領域。
【背景技術】
[0002] 血漿是血液除去血細胞和血小板外的液體組分，約占全血體積的50-60 %。通過抗 凝采血管采集血液，離屯、后收集到的上層淡黃色液體即為血漿。研究表明，在血漿中除了水 分、血漿蛋白、氨基酸、糖類和無機鹽等化學成分外，還存在游離于細胞之外的脫氧核糖核 酸分子，稱為血漿細胞游離DNA。近年來，血漿細胞游離DNA在醫學診斷中的應用不斷拓展， 其廣泛應用于無創產前篩查、腫瘤液體活檢和腫瘤個體化用藥指導等領域。
[0003] 提取高質量的血漿細胞游離DNA是對其進行深入研究和進行醫學診斷的基本前 提。血漿細胞游離DNA由于其片段短(幾十到幾百bp不等）、豐度低（正常人體血漿中每毫升 含量為幾納克至幾十納克）的特點，其提取難度大于體細胞的基因組DNA。在實際應用中，為 了避免DNA片段信息的丟失，對于血漿細胞游離DNA的提取有著高效提取、避免損失的要求。 目前用于提取血漿細胞游離DNA的方法主要有離屯、柱法和磁珠法兩大類，但是在實際應用 中均存在提取效率偏低、部分DNA片段易丟失、批次操作效果不均一的問題，運對于血漿細 胞游離DNA的研究應用造成了不利影響。

【發明內容】

[0004] 本發明公開了一種基于磁珠法的高效血漿細胞游離DNA的提取方法，該方法能高 效、快速地獲得高質量的細胞游離DNA，可W滿足PCR擴增、定量和定性分析、測序等分子生 物學實驗的要求。
[0005] 為實現本發明的目的，本發明采用的技術方案是：
[0006] -種基于磁珠法的高效血漿細胞游離DNA提取方法，具體包括如下步驟：
[0007] (1)預處理，取血漿樣品置于離屯、管中，加入預處理液P，在50-60°C水浴中保存 0.5-化，預處理液P: 0.5-3% (w/v)蛋白酶K，l-3mM氯化巧。由于血漿細胞游離DNA能與蛋白 形成復合物，因此通過預處理降解血漿蛋白，有助于提高血漿細胞游離DNA的捕獲效率和實 驗結果一致性。
[000引（2)配置結合液B，在兩步溫控條件下采用徑基磁珠特異性吸附樣品中的DNA，具體 地，向經過預處理的樣品中加入結合液B;縱滿振蕩15-30S;在50-60°C水浴中反應3-5min; 從水浴中取出離屯、管，縱滿振蕩15-30S;使用旋轉混合儀，在室溫條件下反應5-lOmin;計時 結束后，在3000-4000g條件下離屯、30-60S，將離屯、管放在磁力架上，靜置l-2min進行磁珠分 離，計時結束后用移液器除去上清，保留磁珠。上述用到的結合液Β:92-98%(v/v)異丙醇， 1-3% (v/v)非極性溶劑，1-5% (v/v)磁珠懸浮液，其中，磁珠懸浮液為20% (w/v)納米磁珠， 非極性溶劑為石油酸、正己燒、四氯化碳、苯中的一種或多種混合，添加非極性溶劑的目的 是增加溶液環境的非極性，促進核酸分子被納米磁珠吸附。
[0009] (3)洗涂，配置洗涂液W1和W2對吸附有DM的磁珠進行清洗，具體地，首先鹽洗涂去 除雜質，向完成吸附、去除上清、留有磁珠的離屯、管中加入洗涂液W1，縱滿振蕩2-3min;靜置 l-2min后在3000-4000g條件下離屯、30-60S，將離屯、管放在磁力架上，靜置l-2min進行磁珠 分離，計時結束后用移液器除去上清，保留磁珠;然后進行醇洗涂去除鹽分，向完成吸附、去 除上清、留有磁珠的離屯、管中加入洗涂液W2，縱滿振蕩2-3min;靜置l-2min后在3000-4000g 條件下離屯、30-60S，將離屯、管放在磁力架上，靜置l-2min進行磁珠分離，計時結束后用移液 器除去上清，保留磁珠，敞開管口室溫放置lOminW便乙醇揮發，洗涂液Wl:5-20mM^徑甲基 氨基甲燒，l-5mM乙二胺四乙酸，60-75% (v/v)乙醇;洗涂液W2:70-80% (v/v)乙醇。
[0010] (4)加入洗脫液T，在物理強化作用下輔助洗脫，經過充分混合洗脫后，進行磁珠分 離，然后用移液器吸取上清液體，此液體即為提取的血漿細胞游離DNA，所述的物理強化作 用為縱滿震蕩、超聲波、高溫中的一種或多種組合，其中，洗脫液T:8-10mMS徑甲基氨基甲 燒，抑= 8.0。物理強化作用可W增加分子運動，促進核酸分子從納米磁珠上的解吸。具體 地，向完成第二步洗涂、去除上清、留有磁珠的離屯、管中加入洗脫液T，將離屯、管縱滿振蕩1- 2min后置于盛有冰水的燒杯中，將燒杯放入超聲清洗機反應15-30S，取出離屯、管，在50-60 °C水浴中保存2-3min;再次將離屯、管置于盛有冰水的燒杯中，將燒杯放入超聲清洗機反應 15-30S，取出離屯、管，室溫放置5-lOmin;計時結束后，將離屯、管放在磁力架上，靜置l-2min 進行磁珠分離，計時結束后用移液器吸取上清液體，此液體即為提取的血漿細胞游離DM。
[0011] 進一步地，步驟（2)中所使用的徑基磁珠為徑基修飾的超順磁納米磁珠，粒徑為 300-1000ηπι。
[0012] 本發明在預處理過程中，為保證縱滿振蕩混勻的效果，所提取的血漿樣品量不得 超過所使用離屯、管最大裝液量的2/15。一般小量提取20化1血漿樣品時，使用1.5ml離屯、管； 大量提取2ml血漿時，使用15ml離屯、管。
[0013] 作為優選的，本發明在預處理過程中，預處理液P的用量為血漿樣品量的1/10~1/ 5。
[0014] 本發明在吸附過程中，結合液B的用量為血漿樣品量的3~4倍。
[0015] 本發明在洗涂過程中，洗涂液W1的用量為血漿樣品量的4~5倍，洗涂液W2的用量 為血漿樣品量的4~5倍。
[0016] 本發明在洗脫過程中，洗脫液T的用量不少于20μ1，Κ保證洗脫效率，所使用的超 聲清洗儀的工作頻率為35000-40000ΗΖ，工作功率為500-600W。
[0017]有益效果
[0018] 1.本發明在結合液Β中添加非極性組分，促進核酸分子被納米磁珠的吸附，在兩步 溫控吸附條件下，可W提升DNA的提取效率；
[0019] 2.使用物理強化作用促進核酸分子從納米磁珠上的解吸，增加洗脫效率。由于血 漿細胞游離DNA的片段長度短(幾十到幾百bp)，因此物理強化作用對于DNA長片段的剪切破 壞甚微，不影響所提取DNA的質量。
【附圖說明】
[0020] 圖1為利用本方法提取的血漿細胞游離DNA產物經PCR后的凝膠電泳圖。
[0021] 圖中：泳道1為使用體細胞基因組為模板的陽性對照，泳道2-4為Ξ平行實驗的擴 增產物，泳道5為TAKARA D2000DNA marker，泳道6為用無菌水為模板的陰性對照。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細說明。
[0023] 實施例1 一種基于磁珠法的高效血漿細胞游離DNA的提取方法，其特征是，具體步驟如下：
[0024] (1)預處理
[0025] 設置Ξ平行實驗。取20化1來自健康人的新鮮血漿樣品置于離屯、管中，加入20μ1預 處理液Ρ，在50°C水浴中保存0.化；
[0026] (2)吸附
[0027] 向經過預處理的樣品中加入800μ1結合液B;縱滿振蕩30s;在50°C水浴中反應 5min;從水浴中取出離屯、管，縱滿振蕩15s;使用旋轉混合儀，在室溫條件下反應lOmin;計時 結束后，在4000g條件下離屯、30s，將離屯、管放在磁力架上，靜置2min進行磁珠分離，計時結 束后用移液器除去上清，保留磁珠；
[002引（3)洗涂
[0029] 第一步鹽洗涂去除雜質。向完成吸附、去除上清、留有磁珠的離屯、管中加入ΙΟΟΟμΙ 洗涂液W1，縱滿振蕩3min;靜置2min后在4000g條件下離屯、30s，將離屯、管放在磁力架上，靜 置2min進行磁珠分離，計時結束后用移液器除去上清，保留磁珠；
[0030] 第二步醇洗涂去除鹽分。向完成吸附、去除上清、留有磁珠的離屯、管中加入ΙΟΟΟμΙ 洗涂液W2，縱滿振蕩3min;靜置2min后在4000g條件下離屯、30s，將離屯、管放在磁力架上，靜 置2min進行磁珠分離，計時結束后用移液器除去上清，保留磁