細菌類漆酶laclK的基因和蛋白及應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物技術領域，具體地，設及一種細菌類漆酶lac化的蛋白、編碼該蛋 白的基因、該蛋白的應用W及一種脫色的方法。
【背景技術】
[0002] 染料廣泛應用于紡織染色、紙張、化妝品、食品等行業。工業上，全世界每年使用的 染料和色素有近10000種，超過7 X105噸。在染色過程中，有10-15%的染料隨著廢水排放。 有色工業廢水水質成分復雜，毒性大，嚴重危害到水生生物和人類的健康。所W廢水中染料 的去除或降解對生態環境和生物健康都具有極其重要的意義。
[0003] 目前處理染料廢水的方法有物理法、化學法及生物法。物理法和化學法存在有很 多不足，如高成本，低效率，條件限制，其他廢水成分的干擾，形成毒性更大的副產物W及密 集的能源需求等。生物法主要是依靠微生物合成的酶，如漆酶，細胞色素 P450,木質素降解 酶等。生物法具有高效、無二次污染、運行成本低、綠色環保的優勢，是處理染料廢水的有效 手段。其中，W漆酶的應用最為廣泛。
[0004] 漆酶（Laccase)是指苯二酪：氧-氧化還原酶（benzenediol:oxygen oxidoreductases，EC 1.10.3.2)，是催化多種芳香類底物氧化并同時將分子氧還原為水的 藍色多銅離子氧化酶(blue multicopper oxidases,MC0)。漆酶可W借助氧將對苯二酪(氨 釀)氧化成對苯釀。田彥六郎（1883)在漆樹的樹液中發現能使"樹漆"氧化硬化的酶，后來貝 特蘭德(G. E. Bertrand，1894)詳細地研究了東南亞產的漆中的酶，命名為漆酶。漆酶廣泛分 布于植物和真菌中，且不同物種中的漆酶的分子量各不相同，在30-70kDa之間。漆酶獨特的 催化特性使其在生物檢測中有廣泛的應用，作為高效的生物檢測器而成為底物、輔酶、抑制 劑等成分分析的有效工具和手段。漆酶構成的生物檢測器主要有兩種:漆酶電極和漆酶酶 標。
[0005] 但是，現有的漆酶的長期穩定性和耐熱性較差，因此限制了漆酶的適用范圍。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提高漆酶的長期穩定性和耐熱性，提供一種適用范圍更廣的漆 酶。
[0007] 為了實現上述目的，一方面，本發明提供了一種細菌類漆酶lac化的蛋白，其中，該 蛋白的氨基酸序列與SEQ ID N0:1具有至少90%的一致性，并且具有漆酶活性。
[000引另一方面，本發明還提供了一種細菌類漆酶lac化的基因，該基因編碼如上所述的 細菌類漆酶laclK的蛋白。
[0009] 再一方面，本發明還提供了一種脫色的方法，其中，該方法包括:將待脫色的物料 與如上所述的細菌類漆酶lac化的蛋白在酶促反應條件下接觸。
[0010] 再一方面，本發明還提供了如上所述的細菌類漆酶lac化的蛋白在染料的檢測分 析和印染廢水的處理中的應用。
[0011] 通過上述技術方案，本發明的細菌類漆酶lac化的蛋白的最適反應溫度為65°C，60 °C保持6d酶活無損失，80°C半衰期為83h;在抑2.5、4°C條件下保存7d，剩余酶活超過70%， 即具有較好的長期穩定性和耐熱性，因此能夠在更廣闊的適用范圍內得W應用。
[0012] 本發明的其他特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予W詳細說明。
【附圖說明】
[0013] 附圖是用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具 體實施方式一起用于解釋本發明，但并不構成對本發明的限制。在附圖中：
[0014] 圖1是SDS-PAGE電泳分析LaclK蛋白的結果。其中，由左至右的泳道分別為蛋白 Maker、菌體裂解上清、菌體裂解沉淀、純化的Lac化。
[0015] 圖2是實施例2中給酶量對乙基紫脫色的影響的結果圖。
[0016] 圖3是實施例2中時間對乙基紫脫色的影響的結果圖。
[0017] 圖4是實施例2中乙基紫濃度對乙基紫脫色的影響的結果圖。
[001引圖5是實施例2中抑值對乙基紫脫色的影響的結果圖。
[0019] 圖6是實施例2中面離子對乙基紫脫色的影響的結果圖。
[0020] 圖7是實施例2中有機試劑對乙基紫脫色的影響的結果圖。
[0021 ]圖8是實施例4中Lac化酶活隨溫度和時間變化的情況的結果圖。
[0022] 圖9是實施例5中Lac化對多種染料進行脫色的結果圖。
【具體實施方式】
[0023] W下結合附圖對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描 述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0024] 本發明提供了一種細菌類漆酶lac化的蛋白，其中，該蛋白的氨基酸序列與SEQ ID NO: 1具有至少90 %的一致性，并且具有漆酶活性。
[002引其中，SEQ ID N0:1 的序列為 MTTTIYTN 肥 QVLMGI 化迎)DTRPEKNNMALHVCENPETIIQNREHLAASI 細化孤 FVCANQT 服 AT YYKVTAADK GRGTLRA孤AIPATDALYT陽PNIVLSSFTADCVPVLFYATDSTLIGAI服GWQGTVKEISLKTFTHLKE肥HVDLT NVRVQIGTALS犯K陽VD邸VYTKFKTLGYANDWMYF邸ATQKYHIDNQQTVKKQCELAGIPAEN口IENVCTFKSD SGFSYRQHKQAGRHLSFIVRK 0
[0026] 其中，所述漆酶活性是指苯二酪：氧-氧化還原酶（benzenediol:oxygen oxidoreductases , EC 1 . 10.3.2 )的活性。該活性可W按照酶學委員會（Enzyme Commi S S i on)規定的標準進行測定。
[0027] 其中，優選地，該蛋白的氨基酸序列與SEQ ID NO: 1具有至少95%的一致性，更優 選具有至少99%的一致性;特別優選地，該蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的序列。
[0028] 本發明還提供了一種細菌類漆酶lac化的基因，其中，該基因編碼如上所述的細菌 類漆酶lac化的蛋白。
[0029] 其中，可W按照如上所述的細菌類漆酶lac化的蛋白的氨基酸序列，依據密碼子對 照表，得到編碼如上所述的細菌類漆酶lac化的蛋白的基因的核巧酸序列。
[0030] 其中，特別優選地，該基因的核巧酸序列為SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4所示的序 列。
[0031] 本發明還提供了一種脫色的方法，其中，該方法包括:將待脫色的物料與如上所述 的細菌類漆酶laclK的蛋白在酶促反應條件下接觸。
[0032] 其中，所述酶促反應條件可W包括:溫度為40-100°C，優選為55-70°C，更優選為 60-65 °C。
[0033] 其中，所述酶促反應條件可W包括:時間為1-20天，優選為6-20天，更優選為10-20 天。
[0034] 優選地，所述酶促反應條件還包括:所述酶促反應使用2，2 連氮-二(3-乙基苯并 嚷挫嘟-6-橫酸）作為調節劑。2,2'-連氮-二（3-乙基苯并嚷挫嘟-6-橫酸）的使用濃度可W 為0.01-lmM。
[0035] 其中，由于本發明的細菌類漆酶lac化具有優異的熱穩定性，優選地，該方法還包 括:將待脫色的物料與如上所述的細菌類漆酶lac化的蛋白混合后加熱至90-130°C。其中， 加熱至90-130°C的操作可W在酶促反應之前或酶促反應進行的過程中進行。加熱至90-130 °(：的時間沒有特別的要求，可W為10-150小時。加熱至90-130°C后，本發明的細菌類漆酶 lac化的蛋白仍然能夠保留漆酶活性不喪失。
[0036] 其中，所述待脫色的物料包括Ξ苯甲燒類染料、偶氮類染料和酪類染料中的至少 一種；優選地，所述Ξ苯甲燒類染料包括孔雀石綠、燦爛綠、結晶紫、堿性品紅、乙基紫和維 多利亞藍B中的至少一種，所述偶氮類染料包括剛果紅和/或甲基紅;所述酪類染料包括亞 甲基藍、甲苯胺藍、藏紅T和漠酪藍中的至少一種。
[0037] 本發明還提供了如上所述的細菌類漆酶lac化的蛋白在染料的檢測分析和印染廢 水的處理中的應用。
[0038] 其中，本發明的Lac化脫色乙基紫的抑范圍可W在5-9，優選為6-9，更優選為7-9。
[0039] 實施例1
[0040] 使用購自中國農業微生物菌種保藏管理中屯、的華癸庫特氏菌化urthia huakuii LAM0618T)作為原始菌，擴大培養并提取其基因組DM作為擴增模版;該華癸庫特氏菌是本 發明的發明人發現并已經在學術期刊文獻中公開的。
[0041] 使用引物（CGC GGATCC ATGACAACAACAATTTATACG，SEQ ID ^:5;和，0：6 CTCGAG TTACTTTCGCACGATAAAGCT，沈Q ID N0:6)對上述擴增模版進行PCR擴增，并且使用BamH巧口 化〇1內切酶對擴增產物進行酶切并克隆至表達載體祀T28a中，得到祀T28a-lac化原核表達 質粒，經測序驗證，該祀T28a-lac化原核表達質粒中包含如SEQ ID NO:3所示的外源基因表 達序列，并能正確表達如SEQ ID NO: 1所示的蛋白。
[0042] 將上述pET28a-laclK原核表達質粒導入E.coli BL2UDE3)細胞中，得到E.coli 化21 (DE3)/祀T28a-lac化原核表達菌株。
[0043] 1^8培養基(含504肖/血卡那霉素），371：、180以111111搖床培養到006日日-0.6，加入終濃 度為0.2mM的IPTG和0.2mM CuS〇4 · 5出0，16°C、120r/min搖床繼續培養16h,誘導Lac化蛋白 的表達。
[0044] 非變性條件下6XHis標簽重組LaclK蛋白的純化參考QIAexpress Ni-NTA Fast 8化的化iKlbook手冊操作。利用Ni-NTA柱親和純化蛋白，洗脫液經50mM Tris-HCl(抑8.0) 緩沖液反復超濾，脫鹽和除去咪挫。純化的蛋白融于50mM Tris-HCl (pH 8. ο)，4°C保存備 用。SDS-PAGE電泳分析Lac化蛋白，結果如圖1所示，表明目的蛋白Lac化已獲得純化。
[0045] W2,6-二甲氧基苯酪為底物測定酶活力