一種醛酮還原酶突變體、基因、工程菌及其應用
【專利說明】-種酵酬還原酶突變體、基因、工程菌及其應用 (-)技術領域
[0001] 本發明設及一種阿托伐他汀雙手性中間體的制備方法，特別設及一種乳酸克魯維 酵母醒酬還原酶突變體和編碼基因、載體、重組工程菌，W及該醒酬還原酶在不對稱還原6- 氯基-(5R)-徑基-3-幾基己酸叔下醋制備阿托伐他汀雙手性中間體6-氯基-(3R，5R)-二徑 基己酸叔下醋中的應用。 (二)【背景技術】
[0002] 6-氯基-(3R，5R)-二徑基己酸叔下醋，是阿托伐他汀合成工藝路線中的重要手性 中間體，也是關鍵的藥效基團。由于各國藥監部口對藥物手性純度設置嚴苛的限制(e.e.值 >99.5%，d.e.值>99%) ,6-氯基-(3R，5R)-二徑基己酸叔下醋的合成技術成為阿托伐他汀 合成的關鍵核屯、技術。傳統的6-氯基-(3R，5R)-二徑基己酸叔下醋化學合成工藝從酬酸 (醋）出發，通過不對稱合成構建手性中屯、，反應路線復雜，需要使用易燃易爆的棚燒、正下 基裡等及深冷等特殊環境，導致產物d. e.值低、得率低、能耗大。而且，反應產生的棚化物廢 物處理困難，需要經過繁瑣的反復甲醇澤滅、真空蒸饋處理。酶具有優異的選擇性、反應條 件溫和，一般在常溫、常壓及近中性條件下進行，把分解、異構化、外消旋化、重排等不利副 反應降到最低限度，生物催化技術具備提高過程原子經濟性、實現過程綠色環境友好的基 本條件。因此，開發生物不對稱還原6-氯基-(5R)-徑基-3-幾基己酸叔下醋合成6-氯基- (3R，5R)-二徑基己酸叔下醋技術，具有巨大的經濟效益和社會效益。
[0003] 醒酬還原酶超家族是一類NAD(P化依賴型氧化還原酶，廣泛分布于動物、植物和微 生物細胞內，參與細胞內代謝反應，消除環境中有害物質對細胞的不良影響。目前已發現的 醒酬還原酶已超過190種，分布于16個家族。醒酬還原酶通常為約320個氨基酸組成單亞基 蛋白，大小為34-3化Da,具有(α/β)8筒狀結構，其催化四聯體由酪氨酸(Tyr)、組氨酸化is)、 天冬氨酸(Asp)和賴氨酸化ys)構成，底物作用譜寬，包括脂肪族和芳香組醒和酬、單糖、類 固醇及前列腺素等。目前已有許多醒酬還原酶基因被克隆并在外源宿主中表達廣泛用于不 對稱合成手性中間體，其中一些被用于不對稱還原合成阿托伐他汀中間體6-氯基-(3R, 5R)-二徑基己酸叔下醋。
[0004] 我們已經從乳酸克魯維酵母Kluyveromyces lactis CCTCC Μ 2014380克隆得到 的醒酬還原酶K1AKR，并在大腸桿菌化scherichia coli)實現異源過量表達化nzyme and Microbial Technology 2015，77:68-77)。該酶能夠催化6-氯基-(5R)-徑基-3-幾基己酸叔 下醋不對稱還原合成6-氯基-(3R，5R)-二徑基己酸叔下醋，產物de值大于99%。但該酶對6- 氯基-(5R)-徑基-3-幾基己酸叔下醋的活力并不高，從而限制了其工業化應用。通過已報道 的醒酬還原酶晶體結構，利用分子模擬手段，確定該酶的空間結構和可能的與活性相關的 氨基酸位點，通過定點突變技術提高醒酬還原酶對6-氯基-(5R)-徑基-3-幾基己酸叔下醋 的催化活力，將具有較強的工業應用價值。 (Ξ)
【發明內容】
[0005] 本發明目的是針對之前報道的醒酬還原酶KIAKR對6-氯基-(5R)-徑基-3-幾基己 酸叔下醋不對稱還原活性較低的問題，提供一種醒酬還原酶突變體蛋白質及其編碼基因， 含有該基因的重組表達載體和重組工程菌，將表達該醒酬還原酶突變體的重組工程菌破碎 之后的粗酶液作為催化劑催化6-氯基-(5R)-徑基-3-幾基己酸叔下醋的不對稱還原反應， 制備光學純6-氯基-(3R，5R)-二徑基己酸叔下醋。與野生型醒酬還原酶相比，本發明提供的 醒酬還原酶突變體具有更高的催化活性。
[0006] 本發明采用的技術方案是：
[0007] 本發明提供一種醒酬還原酶突變體，所述醒酬還原酶突變體是將SEQ ID NO. 1所 示氨基酸序列的第295位、第296位進行單突變或雙突變獲得的，優選所述醒酬還原酶突變 體是將SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第295位進行單突變或對第295位和第296位進行雙 突變獲得的。
[000引進一步，優選所述單突變是將SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第295位酪氨酸突變 為色氨酸，氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示，核巧酸序列為SEQ ID NO.5所示;所述雙突變為 將SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第295位酪氨酸突變為色氨酸，并將第296位色氨酸突變 為亮氨酸，氨基酸序列為SEQ ID NO 3所示，核巧酸序列為SEQ ID NO.6所示。
[0009] 本發明使用定點飽和突變技術對醒酬還原酶K1AKR編碼基因進行突變，連接表達 載體后轉化宿主大腸桿菌，誘導表達后再通過高效液相檢測方法將活性提高的正突變檢 出。獲得的突變體能催化（1~50g/L)6-氯基-(5R)-徑基-3-幾基己酸叔下醋不對稱還原，審U 備光學純6-氯基-(3R，5R)-二徑基己酸叔下醋，具體方法如下：來源于K.lactis CCTCC Μ 2014380克隆得到的醒酬還原酶KlAKR(GenBank accession number :KU145407)由309個氨 基酸殘基組成，已成功構建表達載體pET28b-klakr，功能正常的酶蛋白在大腸桿菌化21 (DE3)中實現過量表達。然后經過同源建模和分子對接，根據最優構象選擇潛在的可能影響 酶活性的位點。設定定點飽和突變位點，再設計并合成適當的引物，W所述的含親本醒酬還 原酶基因的重組表達質粒為模板，PCR擴增全長突變基因的質粒。通過將含有全長突變的質 粒轉化到適當的宿主細胞，經培養、誘導表達、篩選出具有高活性的陽性突變子。最后從陽 性突變子中抽提出質粒DNA，進行DNA測序分析，W確定引物的突變。在本發明醒酬還原酶突 變體的制備中，可W采用任何合適的載體。
[0010] 本發明還提供一種所述醒酬還原酶突變體編碼基因，所述醒酬還原酶突變體編碼 基因構建的重組載體及重組基因工程菌，優選所述重組質粒是祀T28b;所述宿主細胞是大 腸桿菌E.coli BL2UDE3)。
[0011] 本發明還設及醒酬還原酶突變體編碼基因在制備重組醒酬還原酶中的應用，所述 應用為:構建含所述醒酬還原酶突變體基因的重組載體，將所述重組載體轉化至宿主菌(優 選大腸桿菌）中，獲得的重組基因工程菌進行誘導培養，培養液分離得到含有重組醒酬還原 酶的菌體細胞，與野生型醒酬還原酶相比，具有更高的催化活性。
[0012] 本發明還設及一種所述醒酬還原酶突變體在制備6-氯基-(3R，5R)-二徑基己酸叔 下醋中的應用，具體所述的應用W含醒酬還原酶突變體基因的重組基因工程菌經發酵培養 獲得的濕菌體為催化劑，W6-氯基-(5R)-徑基-3-幾基己酸叔下醋為底物，W含葡萄糖脫氨 酶基因的工程菌發酵培養獲得的葡萄糖脫氨酶濕菌體為輔酶再生酶，W葡萄糖為輔助底 物，W抑7.0、lOOmM憐酸鹽緩沖液為反應介質，將催化劑和葡萄糖脫氨酶濕菌體用反應介 質懸浮，超聲破碎，再加入底物和輔助底物，在30°C，200r/min條件下反應，反應完全后，獲 得6-氯基-(3R，5R)-二徑基己酸叔下醋;所述葡萄糖脫氨酶W含葡萄糖脫氨酶基因的工程 菌化scherichia Co 1 i BL21 (DE3)/pET28b-esg化)發酵培養獲得濕菌體，具體所述重組基 sibiricum的葡萄糖脫氨酶基因 （GenBank No .KM817194.1)插入祀T-28b構建重組表達質 粒，并將該重組質粒導入大腸桿菌制得的;所述葡萄糖脫氨酶濕菌體用量為10-250g/L緩沖 液(優選25g/L)，所述催化劑的用量W濕菌體重量計為10-250g/L緩沖液(優選75g/L)，所述 底物終濃度為1-lOOg/L緩沖液(優選50g/L)，所述葡萄糖的終濃度為5-300g/L緩沖液(優選 200g/L)。
[0013]進一步，所述催化劑按如下方法制備:將含醒酬還原酶突變體基因的重組工程菌 接種至含終濃度50mg/L卡那霉素的LB液體培養基中，37 °C培養lOh，再W體積濃度4 %接種 到新鮮的含終濃度50mg/L卡那霉素的LB液體培養基中，37°C培養至菌體濃度0D6日日為0.6- 0.8，再向培養液中加入終濃度為9g/L的乳糖，28 °C培養1化后，4 °C、8000g離屯、lOmin，收集 菌體細胞。所述含葡萄糖脫氨酶基因的工程菌發酵培養獲得的濕菌體制備方法同含醒酬還 原酶突變體基因的重組工程菌。進一步，所述超聲破碎條件為:冰浴置于超聲破碎儀中，W 400W功率破碎20min，破Is停Is。
[0014]本發明所述葡萄糖脫氨酶濕菌體制備方法為：將來源于Exiguobacterium sibiricum的葡萄糖脫氨酶基因 （GenBank No .KM817194.1)插入祀T-28b構建重組表達質 粒，并將該重組質粒導入大腸桿菌Escherichia Coli BL2UDE3)獲得含葡萄糖脫氨酶基因 的重組基因工程菌;將含葡萄糖脫氨酶基因的重組工程菌接種至含終濃度50mg/L卡那霉素 的LB液體培養基中，37 °C培養lOh，再W體積濃度4 %接種到新鮮的含終濃度50mg/L卡那霉 素的LB液體培養基中，37°C培養至菌體濃度OD600為0.6-0.8,再向培養液中加入終濃度為 9g/L的乳糖，28 °C培養1化后，4°C、8000g離屯、1 Omin，收集菌體細胞。
[0015] 本發明所述的醒酬還原酶突變體可工程菌全細胞形式使用，也可