穩定表達綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉白細胞株的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬生物技術、微生物動物細胞系領域，涉及骨髓增生異常綜合征轉白細胞株，具體涉及一種穩定表達綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉白細胞株及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002]現有技術公開了骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndeome，MDS)是一組克隆性細胞異常增生的疾病，以無效造血、病態造血及高風險向急性髓系白血病(AML)轉化為特點，其中，約20%-30%的MDS患者向AML進展。據報道，在美國，MDS是最常見的髓系來源的腫瘤，男性發病率高于女性，平均每15個美國人中有3-4人患有MDS;隨著年齡的增加，MDS的發病率逐漸增加;在年齡大于60歲的患者中，發病率高達7-35/10萬，有研究顯示先前行化療及放療治療的患者是MDS發病的高危人群。有統計顯示，我國MDS的發病率為1.45/10萬，略低于歐美國家，隨著我國老齡化進程逐漸加劇，MDS的發病率也呈持續上升狀態。基于形態學、分子生物學、細胞遺傳學和免疫表型，世界衛生組織(WHO)將MDS分為:難治性血細胞減少癥伴單系病態造血(RCUD)、難治性血細胞減少伴多系病態造血(RCMD)、環形鐵粒幼細胞性難治性貧血(RARS)、難治性貧血伴原始細胞增多I型(RAEB-1)、難治性貧血伴原始細胞增多2型(RAEB-2)、5q-綜合征、不能分類的MDS(MDS-U)。
[0003]研究顯示，在MDS的早期階段，造血細胞過度凋亡導致一系或者多系細胞減少。在MDS中細胞遺傳學的進一步改變導致造血細胞增殖加速、分化受阻，最終進展為AML。與初發AML(de novo AML)相比，MDS轉化的AML(sAML)患者年齡偏大，治療難度大，常常不能應用異基因造血干細胞移植(Al 1-HSCT)和強烈化療進行治療，其預后不佳;研究還顯示，隨著地西他濱及阿扎胞苷等去甲基化藥物的研發，治療MDS的手段取得了突破性進展，但該些藥物對高危MDS和sAML的治療作用有限。由于臨床實踐缺乏有效的治療手段，體內的白血病細胞難以清除，最終威脅患者的生命;然而，目前國內外缺乏有效可靠的體內外研究平臺，嚴重制約了MDS的基礎及臨床前研究。
[0004]隨著基因標記技術的發展，細胞示蹤在腫瘤的研究中得到了越來越多的應用；綠色焚光蛋白(green fluorescent protein,GFP)可以在相應波長的紫外光激發下發出綠色熒光，與傳統的新霉素耐藥基因(NeoR)和編碼大腸桿菌β-半乳糖苷酶的Lac-Z基因標記技術相比，GFP標記腫瘤細胞具有動態直觀、操作簡便、檢測方便、靈敏度高的優點，可以靈敏地顯示腫瘤細胞的位置，并進行定量研究，可應用于微小殘留病等的研究，而且隨著動物活體成像技術的發展，GFP也適合體內細胞的觀察；同時，由于其分子量小，GFP可以與其他目的基因表達產物形成融合蛋白，不影響目的蛋白的空間構象和功能，用于目的蛋白的位置標記、功能和定量研究;基于以上幾點，以GFP進行細胞示蹤為相關的腫瘤的研究提供了新的平臺。
[0005]微量殘留白血病(minimal residual leukemia,MRL)是指白血病經誘導治療獲得完全緩解后體內殘留少量白細胞的狀態，其是白血病復發的根源；由于微小殘留白血病分布隱蔽，通常臨床不易檢測，成為MRL研究的瓶頸。
[0006]基于現有技術的現狀，本申請的發明人擬提供使GFP高效和穩定地在細胞中表達的技術方案，具體涉及提供一種穩定表達綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉白細胞株及其制備方法，進一步用于建立小鼠動物模型，利用熒光在成像上的優勢，在動物體內長期觀察，明確白血病細胞分布模式;為微小殘留病的研究提供平臺。
[0007]與本發明相關的現有技術有:
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【發明內容】
[0022]本發明的目的是基于現有技術的現狀，提供一種穩定表達綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉白細胞株及其制備方法，進一步用于建立小鼠動物模型，利用熒光在成像上的優勢，在動物體內長期觀察，明確白血病細胞分布模式;為微小殘留病的研究提供平臺。
[0023]本發明中，將綠色熒光蛋白(GFP)導入細胞，使GFP高效和穩定地在細胞中表達，建立穩定表達綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉白細胞株。
[0024]本發明中，以人骨髓增生異常綜合征轉白細胞系SKM-1為母系細胞，通過攜帶GFP基因的慢病毒進行轉染，以有限稀釋法獲得GFP陽性的單細胞克隆，將擴大培養后的細胞通過皮下注射的方式在小鼠體內篩選，致瘤后將瘤塊分離，繼續進行培養，獲得穩定表達綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉白細胞株SKM-1/GFP，該細胞系能穩定表達GFP。所述的細胞株已于2015年12月28日保藏，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，100101，保藏編號:CGMCC N0.11798,分類命名:人穩定表達綠色熒