在含乙酸的環境中快速利用五碳糖的混菌體系的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及發酵技術領域，具體設及在抑制劑存在下五碳糖、六碳糖共發酵的混 菌體系，尤其是在含乙酸的環境中快速利用木糖的混菌體系。
【背景技術】
[0002] 由于化石資源的過度使用產生了嚴重的環境問題和社會問題，迫切需要開發清 潔、環保的可再生能源，逐步替代傳統的化石資源，W保證現代社會的可持續發展。纖維素 乙醇是一種具備W上特性的新能源，成為最有發展潛力的能源替代品之一。纖維素乙醇的 生產工藝是先將纖維素原料轉化為可發酵的糖類，再通過酵母發酵將糖類轉化為乙醇的過 程。由于木質纖維素的致密結構具有頑抗性，必須對纖維素原料進行預處理來提高水解過 程的效率。然而，多數高效的預處理會有一些副產物的產生，如乙酸。乙酸對后續的微生物 發酵過程有非常嚴重的抑制作用。增強酵母對乙酸耐受性是突破限制因素的有效途徑，可 W增強酵母在運些抑制劑存在下的乙醇生產能力。
[0003] 目前，主要是通過基因工程和進化工程等手段提高酵母的耐受性。進化工程是利 用細胞自身的進化適應能力獲得目標性狀。近幾年，基于已報道的細胞對單一抑制劑的耐 受機制，利用基因工程策略獲得了一些對單一抑制劑耐受能力增強的酵母菌株。
[0004] 木糖是木質纖維素水解液中含量第二高的單糖。在W木質纖維素水解液為原料的 纖維素乙醇生產中，高效、充分的利用木糖是發酵菌株的必備特性。在釀酒工業中廣泛使用 的菌株釀酒酵母因其較高的木質纖維素水解液抑制劑耐受性、乙醇耐受性成為纖維素乙醇 生產中的首選微生物，但是天然釀酒酵母不能代謝木糖。因此，通過工程化改造釀酒酵母， 獲得能夠高效代謝木糖的酵母菌株是纖維素乙醇生產中的一個關鍵問題。通過將能天然代 謝木糖的微生物中的木糖還原酶途徑或木糖異構酶途徑引入到釀酒酵母中，目前已經構建 了很多能較好發酵木糖產乙醇的菌株，但是木糖的發酵效率還有待提高。
[0005] 目前，基于基因工程、進化工程或者誘變等技術，可W獲得一株對乙酸有耐受性的 釀酒酵母或者一株可W較快的代謝木糖的菌株，但是很難得到一株既可W較快代謝木糖又 耐受乙酸的釀酒酵母。在同一株菌內實現耐受性和木糖代謝能力的提高，對于菌株代謝負 擔過重。
【發明內容】
[0006] 有鑒于此，本發明目的是針對現有技術的缺陷，提供一種在含乙酸的環境中快速 利用木糖的混菌體系，W解決酵母在乙酸抑制的情況下的木糖快速利用的問題，實現酵母 在抑制劑存在條件下五碳糖、六碳糖的共發酵。
[0007] 為實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案：
[000引一種混菌體系，包括酵母菌株SyBEOOe和酵母菌株SyBE0036。
[0009]本發明所述混菌體系由乙酸耐受菌Sy邸0036和另一株木糖利用菌Sy肥006組成， 將混菌發酵引入纖維素水解液發酵中，將耐受性和木糖利用的功能分配到不同的菌株，減 輕了每株菌株的代謝負擔，實現了相互合作，功能互補。在解決纖維素預處理水解液中副產 物乙酸對酵母發酵的抑制的同時通過木糖利用菌實現五六碳糖的共利用。
[0010] 在一個具體實施方案中，本發明采用酵母菌株SyBEOOe、酵母菌株SyBE0036按不同 比例混合培養在乙酸抑制的情況下發酵，結果顯示雖然Sy肥0036單獨培養也可快速消耗葡 萄糖和快速生長，但是不能代謝木糖，不可實現五六碳糖的共利用。而酵母菌株SyBEOOe與 酵母菌株SyBE0036混菌培養明顯加快了發酵進程，提前利用木糖，都在30-40小時左右進入 穩定期，消耗盡全部葡萄糖，與單獨培養的Sy肥0036利用情況接近。混合培養的菌株，消耗 盡葡萄糖后，30-40小時左右開始立即代謝木糖。而單獨培養的Sy肥006需要將近100小時才 可W進入穩定期，消耗盡葡萄糖，開始利用木糖。表明酵母菌株Sy肥0036的添加可W明顯加 快發酵進程，縮短發酵時間，完成乙酸抑制下的混糖發酵。而混菌培養的比例不是固定的， 混合比例范圍非常寬泛的。即使添加極少量的SyBE0036都可W明顯加快發酵進程，縮短發 酵時間。
[0011] 作為優選，所述菌株Sy邸006與菌株Sy邸0036的濃度比為1:49~49:1。
[0012] 更優選的，所述菌株Sy邸006與菌株Sy邸0036的濃度比為1: 1。
[0013] 本發明還提供了所述混菌體系在抑制劑存在下五碳糖、六碳糖共發酵中的應用發 酵木質纖維素水解液中的應用。
[0014] 其中，作為優選的，所述抑制劑為乙酸。
[0015] 作為優選的，所述五碳糖為木糖，所述六碳糖為葡萄糖。
[0016] 本發明還提供了一種在抑制劑存在下五碳糖、六碳糖共發酵的發酵方法，接種上 述混菌體系于含抑制劑的五碳糖與六碳糖混合液中發酵。即接種包括酵母菌株SyBEOOe和 酵母菌株SyBE0036的混菌體系。
[0017] 其中，所述抑制劑為乙酸。所述乙酸的濃度優選為3.5g/L-5.0g/L。所述抑制劑為 乙酸，乙酸的濃度為3.5g/L-5. Og/L
[0018] 本發明所述的發酵方法中所述五碳糖為木糖，所述六碳糖為葡萄糖。
[0019] 在一些實施方案中，所述混菌體系中所述菌株Sy邸006與菌株Sy肥0036的濃度比 為1:49~49:1。
[0020] 在一些優選實施方案中，所述混菌體系中所述菌株Sy邸006與菌株Sy肥0036的濃 度比為1:1。
[0021] 本發明所述在抑制劑存在下五碳糖、六碳糖共發酵的發酵方法中所述混菌體系的 接種濃度為初始菌體濃度0D600 = 0.1~1.0。
[0022] 本發明所述發酵方法中所述發酵為30°C、150rpm條件下培養。
[0023] 由上述技術方案可知，本發明提供了一種混菌體系包括酵母菌株SyBEOOe和酵母 菌株SyBE0036。酵母菌株SyBEOOe和酵母菌株SyBE0036混合發酵在解決纖維素預處理水解 液中副產物乙酸對酵母發酵的抑制的同時通過木糖利用菌實現五六碳糖的共利用。本發明 通過混菌發酵成功解決了纖維素乙醇生產過程中存在條件下的木糖利用的問題，實現在酵 母抑制劑存在條件下五六碳糖共發酵。此外，通過酵母菌株SyBEOOe和酵母菌株Sy肥0036混 菌發酵，加速了發酵進程，縮短發酵周期，提高效率，降低成本。
【附圖說明】
[0024] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0025] 圖1示實施例葡萄糖為單一碳源下乙酸對菌株SyBE0036的抑制作用圖，其中， 圖a為葡萄糖濃度曲線、圖b為乙醇濃度曲線、圖C為乙酸濃度曲線、圖d為菌體生長曲線；
[0026] 圖2示實施例2葡萄糖為單一碳源下乙酸對菌株SyBEOOe的抑制作用圖，其中，圖a 為葡萄糖濃度曲線、圖b為乙醇濃度曲線、圖C為乙酸濃度曲線、圖d為菌體生長曲線；
[0027] 圖3示實施例2木糖為單一碳源下乙酸對菌株SyBEOOe的抑制作用圖，其中，圖a為 木糖濃度曲線、圖b為乙醇濃度曲線、圖C為乙酸濃度曲線、圖d為木糖醇濃度曲線、圖e為菌 體生長曲線；
[002引圖4示實施例35.Og/L乙酸濃度抑制下等比例混菌利用葡萄糖、木糖結果圖，其中， 圖a為葡萄糖濃度曲線、圖b為木糖濃度曲線、圖C為乙醇濃度曲線、圖d為菌株SyBEOOe菌體 生長曲線；為菌株SyBEOOe與菌株SyBE0036比例為0:1、:秦為菌株SyBEOOe與菌株 SyBE0036比例為0.02:0.98、雌為菌株SyBEOOe與菌株SyBE0036比例為0.5:0.5、為菌株 SyBEOOe與菌株Sy邸0036比例為0.98:0.02、-為菌株Sy邸006與菌株Sy邸0036比例為1:0;
[0029] 圖5示實施例4乙酸抑制下不同比例混菌利用葡萄糖、木糖結果圖，其中，圖a為葡 萄糖濃度曲線、圖b為木糖濃度曲線、圖C為乙醇濃度曲線；
[0030] 圖6示實施例5 3.75g/L乙酸濃度抑制下等比例混菌利用葡萄糖、木糖結果圖，其 中，圖a為葡萄糖濃度曲線、圖b為木糖濃度曲線、圖C為乙酸濃度曲線、圖d為乙醇濃度曲線。
【具體實施方式】
[0031] 下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的 實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬于本發明保護的范圍。
[0032] 為了更好的理解本發明，下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。其中所述 酵母菌株Sy肥006的構建方法參見《模塊化構建高效利用木糖的釀酒酵母的研究》（查健， [D]，天津大學，2013年）；所述酵母菌株SyBE0036的構建方法參見《釀酒酵母耐受抑制劑的 性能強化》(王昕，[D]，天津大學，2015年）。
[0033] 實施例1:菌株SyBE0036在乙酸抑制下W葡萄糖為單一碳源的發酵
[0034] 1、實驗材料:菌株SyBE0036
[0035] 2、試驗方法：
[0036] Sc-Ura培養基：葡萄糖20g/L，酵母氮源6.7g/L，氨基酸粉末2g/L，不添加尿喀晚， 115 °C滅菌15min。對照組不添加乙酸，實驗組添加1.25g/L乙酸。
[0037] 挑取Sy肥0036單菌落，接種于裝有5mLSC-化a培養基的試管中，在30°C、200巧m條 件下培養24h，取0.5mL接種于裝有lOOmLSC-化a培養基的250血錐形瓶中，在30°C、200rpm條 件下培養2地。然后，W初始菌體濃度0D6日日= 0.1接種于裝有lOOmLSC-Ura培養基的250mL錐 形瓶中，于30°C、150rpm條件下培養，使用722型分光光度計測定菌體生長曲線。葡萄糖濃 度、乙醇濃度、乙酸濃度用高效液相色譜(Watersl515)測定，色譜柱為Aminex HPX-87H，柱 溫:65°C，檢測器:Waters示差檢測器2421，流動相為5mM硫酸溶液，流速0.6mL/min，進樣量 為lOyL。每組實驗重復3次。結果見圖1。
[0038] 3、實驗結果：
[0039] 如圖1所示，菌株SyBE0036在W葡萄糖為單一碳源情況下，添加乙酸的實驗組與未 添加乙酸的對照組的生長速率，葡萄糖消耗速率和乙醇生產速率保持一致，曲線完全重合。 由此可知，在W葡萄糖為單一碳源情況下，乙酸對Sy邸0036基本沒有抑制作用，Sy肥0036表 現出對乙酸較好的耐受性。
[0040] 實施例2:菌株SyBEOOe在乙酸抑制下分別W葡萄糖和木糖為單一碳源發酵
[0041 ] 1、實驗材料:菌株SyBEOOe
[0042] 2、實驗方法：
[0043] Yra培養基:木糖20g/L，酵母浸粉lOg/L，蛋白腺20g/L，121°C滅菌20min。木糖單獨 115°C滅菌 15min。
[0044] SC培養基：葡萄糖20g/L，酵母氮源6.7g/L，氨基酸粉末2g/L，115°C滅菌15min。對 照組不添加乙酸，實驗組添加1.25g/L乙酸。
[0045] SX培養基:木糖20g/L，酵母氮源6.7g/L，氨基酸粉末2g/L，115°C滅菌15min。木糖 單獨115°C滅菌15min。對照組不添加乙酸，實驗組添加1.25g/L乙酸。
[0046] 挑取Sy邸006單菌落，接種于裝有5血YPX培養基的試管中，在30°C、200rpm條件下 培養2地，取0.5mL接種于裝有lOOmLYPX培養基的250mL錐形瓶中，在30°C、200巧m條件下培