一種近交系小鼠胚胎腭突體外旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀及其培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種近交系小鼠胚胎腭突體外旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀及其培養(yǎng)方法，屬于動物胚胎培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]先天性唇腭裂是人類最常見的出生缺陷之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳、環(huán)境等多種因素的相互作用。雖然唇腭裂的確切病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但是體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)研究在揭示唇腭裂的發(fā)病機(jī)制方面已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展。運(yùn)用唇腭裂動物模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，至今仍是最常用的實(shí)驗(yàn)方法。但是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)受機(jī)體本身多種因素的干擾。為排除體內(nèi)因素的影響，器官培養(yǎng)就成為最主要的方法之一。所謂器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或器官組織塊后，不進(jìn)行組織分離而保持其原有器官的結(jié)構(gòu)，直接將器官或器官的一部分在體外生長和移植。其目的是在體外情況下，維持器官內(nèi)部的發(fā)育分化以及結(jié)構(gòu)與功能特征，這樣可以直觀地觀察和研究器官的發(fā)育分化過程。
[0003]20世紀(jì)中期，表面培養(yǎng)方法、懸浮培養(yǎng)方法以及金屬柵欄式培養(yǎng)方法相繼問世，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，涉及唇腭裂發(fā)病的確切病因和機(jī)制正在趨向完善。體外的腭突器官研究在揭示唇腭裂發(fā)病機(jī)制上已經(jīng)取得了很大進(jìn)步，體外動物模型的建立模仿體內(nèi)胚胎發(fā)育，至今仍然是最常用的實(shí)驗(yàn)方法。傳統(tǒng)的腭突組織體外培養(yǎng)方法主要是為腭突組織提供一種靜態(tài)的、二維的體外生長環(huán)境，但是此裝置可以為腭突組織提供動態(tài)、三維生長，較好的模擬體內(nèi)胚胎發(fā)育。使用此組織培養(yǎng)儀，進(jìn)行小鼠腭突組織體外培養(yǎng)，可觀察到腭突成功融合的現(xiàn)象。另外，在小鼠胚胎腭突組織培養(yǎng)過程中，腭突培養(yǎng)24h-48h期間，要進(jìn)行培養(yǎng)液的更換，以保證體外腭突器官有足夠的營養(yǎng)支持，除此之外，腭突器官培養(yǎng)也需要一定的物理性機(jī)械刺激，促進(jìn)其生長發(fā)育融合，而這些物理性機(jī)械力的刺激是傳統(tǒng)腭突組織體外培養(yǎng)方法無法達(dá)到的。
[0004]中國專利CN201210416329.7和CN201310617790.3公開了類似的培養(yǎng)器和培養(yǎng)方法，但是，他們是針對整個胚胎的培養(yǎng)。本發(fā)明在結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步改良了腭突組織的培養(yǎng)方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:提供一種近交系小鼠胚胎腭突體外旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀及其培養(yǎng)方法。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
首先，本發(fā)明提供了一種近交系小鼠胚胎腭突體外旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀，包括載物旋轉(zhuǎn)盤和箱體，載物旋轉(zhuǎn)盤位于箱體的上方；
箱體內(nèi)設(shè)置鋰電池、和控制電路，鋰電池、直流電機(jī)和控制電路互相連接，減速機(jī)與直流電機(jī)相連，載物旋轉(zhuǎn)盤通過傳動軸與減速機(jī)相連；
轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)閥與直流電機(jī)相連;箱體的外壁設(shè)有顯示屏。
[0007]所述的鋰電池是可充電式鋰電池。進(jìn)一步的，箱體的外壁設(shè)有充電口，鋰電池與充電口相連。
[0008]本發(fā)明所述的直流電機(jī)是微型直角渦輪減速直流電機(jī)，箱體是環(huán)保型防水密封優(yōu)質(zhì)的塑料箱體。鋰電池選用輕薄型超能可組合的鋰電池，不僅可以滿足旋轉(zhuǎn)載物臺持續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)時間長的要求，而且相對減小了電池體積。實(shí)現(xiàn)了儀器可用于狹小空間的要求。采用了PffM控制方式，節(jié)能低耗、運(yùn)轉(zhuǎn)平穩(wěn)、可實(shí)現(xiàn)線性無級調(diào)速。布線采用接插件排線模式，結(jié)構(gòu)簡單、裝拆維護(hù)十分方便。根據(jù)鋰電池的容量，充電一次可以旋轉(zhuǎn)48小時以上，這樣可以減少鋰電池的體積，做到整個儀器的小型化，最終能放在細(xì)菌培養(yǎng)箱中。
[0009]本發(fā)明還提供一種利用所述的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀培養(yǎng)近交系小鼠胚胎腭突的方法，包括下列步驟:
(I)將孕13.5天的近交系小鼠脫頸處死，在75%的酒精中浸泡消毒。無菌環(huán)境下，取出胚胎。在解剖顯微鏡下取材，將近交系小鼠胚胎上的融合前的腭突組織取出。
[0010](2)將腭突組織放置于直徑為3cm的培養(yǎng)皿內(nèi)的微孔濾膜上并加入培養(yǎng)液，并保證濾膜漂浮在培養(yǎng)液表面;將置有腭突組織的培養(yǎng)皿放入載物旋轉(zhuǎn)盤，設(shè)定旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀的轉(zhuǎn)速為20-25轉(zhuǎn)/分鐘;一同放到含有5%的二氧化碳、37 °C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0011](3 )步驟(2 )培養(yǎng)24h后，無菌條件下取出旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀并更換培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入相同的培養(yǎng)液，然后在培養(yǎng)液中額外加入殼聚糖，殼聚糖與培養(yǎng)液的重量比是1-2:10;同時將旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀的轉(zhuǎn)速勻速升高到35-40轉(zhuǎn)/分鐘。
[0012](4)步驟(3)培養(yǎng)12h后，無菌條件下取出旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀并更換培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入相同的培養(yǎng)液，然后在培養(yǎng)液中額外加入胎牛血清FBS，胎牛血清FBS與培養(yǎng)液的重量比是2-3:10;同時將旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀的轉(zhuǎn)速調(diào)整為30-35轉(zhuǎn)/分鐘。
[0013](5)步驟(3)培養(yǎng)6h后，將旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀的轉(zhuǎn)速勾速降低到零，每分鐘降低0.5-1轉(zhuǎn)；旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀靜止后，繼續(xù)培養(yǎng)6h，，直到腭突組織的雙側(cè)腭突完全融合，培養(yǎng)結(jié)束。
[0014]優(yōu)選的，步驟(3)中，升高轉(zhuǎn)速時每分鐘升高0.5-1轉(zhuǎn)。
[0015]另外，本發(fā)明的步驟(4)中，加入胎牛血清FBS可以換成牛血清白蛋白(BSA)。
[0016]本發(fā)明使用的培養(yǎng)液的成分為:DMEM/FI2 (1:1 )培養(yǎng)基和10%胎牛血清FBS(Hyclone公司，美國)，1%青霉素-鏈霉素溶液(Hyclone公司，美國)。
[0017]對于胚胎器官來說，其細(xì)胞生長活躍，迀移能力強(qiáng)，組織尚未完全分化，容易受外界的誘導(dǎo)而向其他方向分化生長，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，因此為了維持器官的基本形態(tài)及結(jié)構(gòu)，必須設(shè)置某種抑制物來防止細(xì)胞的迀移以及組織的分化。本發(fā)明中，通過在培養(yǎng)液中加入殼聚糖，起到了很好的防止細(xì)胞迀移以及組織分化的作用。本發(fā)明中加入殼聚糖的分子量是5萬-10萬。
[0018]另外，申請人通過研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)速對胚胎腭突組織的培養(yǎng)非常重要，常規(guī)的靜止培養(yǎng)法，腭突不是水平向生長、靠攏、最終融合，而是向下方生長;導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗;通過旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，旋轉(zhuǎn)力可以克服重力，模擬了胚胎在子宮內(nèi)的環(huán)境(有液體浮力可以減輕胚胎受到的重力)。腭突生長可能對重力很敏感，重力可以改變其生長方向?，F(xiàn)有技術(shù)中，雖然出現(xiàn)了旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)胚胎的方法，轉(zhuǎn)速恒定，但是腭突的培養(yǎng)并不能完全照搬胚胎的方法，腭突只是胚胎中的一個器官，對培養(yǎng)條件要求更高。
[0019]本發(fā)明的有益效果: 1.本發(fā)明的培養(yǎng)儀具有設(shè)計(jì)獨(dú)特、結(jié)構(gòu)緊湊、獨(dú)立供電、操作方便、外形比例協(xié)調(diào)美觀、功耗小、噪音低，耐溫防潮、持續(xù)運(yùn)行時間長、線性無級調(diào)速、運(yùn)行平穩(wěn)、顯示直觀等特點(diǎn)。專業(yè)用于醫(yī)療、生物以及農(nóng)牧等科研機(jī)構(gòu)。
[0020]2.本發(fā)明提供的培養(yǎng)方法模擬腭突器官在近交系小鼠體內(nèi)的顯微環(huán)境，維持器官內(nèi)部的發(fā)育分化以及結(jié)構(gòu)與功能特征，可以更加直觀地觀察和研究腭突器官的發(fā)育及分化過程。
[0021]本發(fā)明的近交系小鼠胚胎腭突體外旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀是在結(jié)合上述腭突培養(yǎng)方法及設(shè)備的優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)而成的。一它允許以較容易的方法進(jìn)行胚胎腭突取材，并且不破壞腭突的自然解剖位置，最大限度的模擬了自然狀態(tài)下(體內(nèi))腭突的發(fā)育過程;二它利用自身的旋轉(zhuǎn)平臺來放置放有體外培養(yǎng)腭突的培養(yǎng)皿，可以在普通的細(xì)胞組織培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，代替了旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱，使其可以普及應(yīng)用。
【附圖說明】
[0022]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0023]圖1是本發(fā)明旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀的結(jié)構(gòu)圖。
[0024]圖2是本發(fā)明體外培養(yǎng)不同發(fā)育時期的腭突體視顯微鏡下位置和形態(tài)的圖像。
[0025]圖3是本發(fā)明體外培養(yǎng)不同發(fā)育時期的腭突冠狀位切片的HE染色圖像。
[0026]I載物旋轉(zhuǎn)盤，2箱體，3鋰電池，4直流電機(jī)，5減速機(jī)，6控制電路，7轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)閥，8顯示屏，9充電口。
【具體實(shí)施方式】
[0027]實(shí)施例1
本實(shí)施例提供了一種近交系小鼠胚胎腭突體外旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀，包括載物旋轉(zhuǎn)盤和箱體，載物旋轉(zhuǎn)盤位于箱體的上方；
箱體內(nèi)設(shè)置鋰電池、和控制電路，鋰電池、直流電機(jī)和控制電路互相連接，減速機(jī)與直流電機(jī)相連，載物旋轉(zhuǎn)盤通過傳動軸與減速機(jī)相連；
轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)閥與直流電機(jī)相連;箱體的外壁設(shè)有顯示屏。
[0028]所述的鋰電池是可充電式鋰電池。進(jìn)一步的，箱體的外壁設(shè)有充電口，鋰電池與充電口相連。
[0029]本實(shí)施例所述的直流電機(jī)是微型直角渦輪減速直流電機(jī)，箱體是環(huán)保型防水密封優(yōu)質(zhì)的塑料箱體。鋰電池選用輕薄型超能可組合的鋰電池，不僅可以滿足旋轉(zhuǎn)載物臺持續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)時間長的要求，而且相對減小了電池體積。實(shí)現(xiàn)了儀器可用于狹小空間的要求。采用了PffM控制方式，節(jié)能低耗、運(yùn)轉(zhuǎn)平穩(wěn)、可實(shí)現(xiàn)線性無級調(diào)速。布線采用接插件排線模式，結(jié)構(gòu)簡單、裝拆維護(hù)十分方便。根據(jù)鋰電池的容量，充電一次可以旋轉(zhuǎn)48小時以上，這樣可以減少鋰電池的體積，做到整個儀器的小型化，最終能放在細(xì)菌培養(yǎng)箱中。
[0030]實(shí)施例2
利用實(shí)施例1提供的儀器，培養(yǎng)近交系小鼠胚胎腭突的方法，包括下列步驟:
(I)無菌環(huán)境下，解剖顯微鏡下取材，將近交系小鼠胚胎上的腭突組織取出。
[0031](2)將腭突組織放置于直徑為3cm的培養(yǎng)皿內(nèi)的微孔濾膜上并加入培養(yǎng)液，并保