一種用于水產養殖的改性低聚殼聚糖及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于水產養殖領域，更具體地，本發明設及一種用于水產養殖的改性低聚 殼聚糖及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 殼聚糖是甲殼素脫乙酷基的產物，是堿性多糖，也是少數帶電荷的天然產物之一， 具有廣譜抑菌、增強機體免疫力、提高動物生產性能、改善動物肉質及凈化水質的作用，并 且來源廣泛，無毒無害、無殘留、無耐藥性，安全又高效，是一種極具開發價值的飼料添加 劑。
[0003] 殼聚糖對大腸桿菌、金色葡萄球菌和綠濃桿菌及白色念球菌等多種細菌均有明顯 的抑制和殺滅作用，表現出較強的抗菌活性。但與已有的化學合成抗菌劑相比，抗菌活性依 然較低且對真菌類基本上沒有抑制活性，另外殼聚糖的抑制作用也因分子量的增大而減 弱，運與殼聚糖分子量越大，水溶性越差有關，從而導致抑菌性減弱。
[0004] 因此目前需要對殼聚糖結構上的C2-N也和C6-OH進行化學改性，來增強制備產物的 溶解性并同時增加抑菌活性中屯、，從而制備一種新型具有多抗菌活性中屯、的抑菌劑。
【發明內容】
[0005] 本發明的第一個方面提供了一種用于水產養殖的改性低聚殼聚糖，所述改性低聚 殼聚糖為低聚殼聚糖上至少接枝贓嗦二酬酸和季錠鹽。
[0006] 在一種優選的實施方式中，所述改性低聚殼聚糖的重均分子量為3000~50000。
[0007] 在一種優選的實施方式中，所述贓嗦二酬酸與低聚殼聚糖的接枝率為1~5%。
[000引在一種優選的實施方式中，所述贓嗦二酬酸選自
[0009] A:
[0013] 中的一種或兩種。
[0014] 在一種優選的實施方式中，所述贓嗦二酬酸A與B摩爾比為(0.3~0.5): 1。
[0015] 在一種優選的實施方式中，所述季錠鹽與低聚殼聚糖的接枝率為1~5%。
[0016] 在一種優選的實施方式中，所述季錠鹽選自
任意一種或多種，式中，X為Cl、B;r、I中的任意一種;η為2~13中的任意一個整數。
[0021 ] 在一種優選的實施方式中，所述季錠鹽C與D、Ε、F之間摩爾比為(0.1~0.2): (0.2 ~0.3):(0.5~0.7):1。
[0022] 在一種優選的實施方式中，所述季錠鹽C與D、E、F之間摩爾比為（0.12~0.18): (0.24~0.28):(0.55~0.66):1。
[0023] 本發明的第二個方面提供了一種改性低聚殼聚糖的制備方法，所述方法包括下述 步驟：
[0024] (1)按重量份將重均分子量在3000~50000的低聚殼聚糖浸入2V 2^%醋酸溶液 和2V 5wt%的過氧化氨溶液中；
[0025] (2)將贓嗦二酬酸溶解于10V甲醇中，再加入到所述步驟（1)得到的低聚殼聚糖溶 液中，得到反應液；
[0026] (3)將所述步驟(2)中得到的反應液用lOwt%化0H水溶液調節抑呈中性后過濾，對 截留物經浸泡、洗涂、過濾和干燥；
[0027] (4)將 X-[ciVi^X 分別與
在溶劑乙臘(5V)反應，減壓除去溶劑，得到季錠鹽；
[0028] (5)將所述步驟（3)合成的低聚殼聚糖贓嗦二酬酷胺分散于丙酬（3V)中，加入 20wt % NaOH水溶液，進行堿化，然后加入季錠鹽，進行季錠化反應，最后出料漿；
[0029] (6)將所述步驟(5)制備的料漿調節中性后過濾，對截留物經浸泡、洗涂和干燥后， 得到改性低聚殼聚糖。
[0030] 參考W下詳細說明更易于理解本申請的上述W及其他特征、方面和優點。
【具體實施方式】
[0031] 參選W下本發明的優選實施方法的詳述W及包括的實施例可更容易地理解本公 開內容。在W下說明書和權利要求書中會提及大量術語，運些術語被定義為具有W下含義。
[0032] 單數形式包括復數討論對象，除非上下文中另外清楚地指明。
[0033] "任選的"或者"任選地"是指其后描述的事項或事件可W發生或不發生，而且該描 述包括事件發生的情形和事件不發生的情形。
[0034] 說明書和權利要求書中的近似用語用來修飾數量，表示本發明并不限定于該具體 數量，還包括與該數量接近的可接受的而不會導致相關基本功能的改變的修正的部分。相 應的，用"大約"、"約"等修飾一個數值，意為本發明不限于該精確數值。在某些例子中，近似 用語可能對應于測量數值的儀器的精度。在本申請說明書和權利要求書中，范圍限定可W 組合和/或互換，如果沒有另外說明運些范圍包括其間所含有的所有子范圍。
[0035] 本申請的第一方面設及用于水產養殖的改性低聚殼聚糖，所述改性低聚殼聚糖分 子結構上至少接枝贓嗦二酬酸和季錠鹽。
[0036] 本發明的改性低聚殼聚糖作為抑菌劑的應用，所述的抑菌劑對革蘭氏陽性菌（金 黃色葡萄球菌）、革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌）、弧菌、嗜水氣單胞菌及溫和氣單胞菌等多種 細菌及白色念珠菌等真菌具有抑制作用。
[0037] 本申請使用的術語"低聚殼聚糖"是指包含殼聚糖單體單元的聚合物。在一種實施 方式中，殼聚糖單體可W由下式表示
[00；3 引
[0039] 在一種實施方式中，低聚殼聚糖可W由下式表示
[0040]
[0041 ] 其中η約為16~310,在優選的實施方式中，η為16~124。
[0042]殼聚糖具有廣譜的抗菌活性，對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌等多種細菌均有明 顯的抑制和殺滅作用。其抗菌作用機理主要分為兩類:對于大分子殼聚糖，主要通過高分子 鏈密集于細菌的表面形成一層高分子膜，影響體外的營養物質向細胞內運輸，阻止代謝物 的排泄，使細菌菌體的新陳代謝素亂，從而達到殺菌抑菌的作用;對于小分子殼聚糖，可W 通過滲透作用到達細菌內部，吸附細胞體內帶有陰離子的細胞質，并使其發生絮凝、變性， 擾亂細菌的正常生理活動，起到抗菌滅菌的作用。
[0043] 殼聚糖可促進郵類蟻殼生長，增強免疫防御能力。此外，還可W改善水質。使用水 產用低分子量殼聚糖粉對養殖水體中的氨態氮和亞硝酸鹽有明顯降低作用，且在改善水質 的同時還能抑制水產動物病原菌生長，預防疾病，使羅氏沼郵活力旺盛、體色鮮艷、品質佳。 殼聚糖作為羅非魚飼料添加劑能在飼料表面形成一層保護膜，從而延長飼料的水化時間W 保護養分;防止霉變，減少對水源的污染。低分子量殼聚糖還可W保護生物體組織細胞膜免 受自由基攻擊，間接降低金屬硫蛋白在儒脅迫下的應激壓力，減輕水生動物受到重金屬的 危害。
[0044] 用殼聚糖降解制備的重均分子質量在5000~10000的低分子殼聚糖對細菌和微生 物有一定抑制作用，且運種抑制作用隨著質量濃度增加而增強.殼聚糖對不同細菌的抑制 效果隨著分子量的變化而變化，殼聚糖對金黃色葡萄球菌的抗菌作用隨分子量減小而逐漸 減弱，對大腸桿菌分子量越小，抗菌作用越明顯。有研究發現，殼聚糖具有抑制變鏈菌生長 的功效，帶正電荷的殼聚糖分子與細菌帶負電荷的細胞膜作用，使其胞壁受損，殼聚糖易透 過受損的胞壁進入胞核內，與分子結合破壞DNA合成，從而具有抗菌活性。
[0045] 重均分子量的測定：當入射光電磁波通過介質時，使介質中的小粒子(如高分子） 中的電子產生強迫振動，從而產生二次波源向各方向發射與振蕩電場(入射光電磁波）同樣 頻率的散射光波。運種散射波的強弱和小粒子(高分子）中的偶極子數量相關，即和該高分 子的質量或摩爾質量有關。根據上述原理，使用激光光散射儀對高分子稀溶液測定和入射 光呈小角度(2°-7°)散射光強度，從而計算出稀溶液中高分子的絕對重均分子量(MW)值。采 用動態光散射的測定可W測定粒子(高分子)的流體力學半徑的分布，進而計算得到高分子 分子量的分布曲線。
[0046] 本申請使用的術語"改性低聚殼聚糖"是指用贓嗦二酬酸改性低聚殼聚糖，再用季 錠鹽對改性的低聚殼聚糖進行改性處理得到。
[0047] 本發明旨在把殼聚糖作為先導化合物，對殼聚糖分子進行修飾。為了增強殼聚糖 的殺菌抑菌活性，本發明采取如下兩種途徑：
[0048] 第一，對殼聚糖分子進行修飾，把具有殺菌抑菌活性的活性基團贓嗦二酬酸接入 殼聚糖分子，使得接入的活性基團與殼聚糖自身的活性相互增效，達到增強殺菌抑菌活性 的目的。
[0049] 第二，增強殼聚糖殺菌抑菌活性。殼聚糖的生物活性源于其C2位活潑的氨基基團， C3和C6位活潑的徑基基團，其中殺菌抑菌活性主要與氨基基團有關，氨基的聚陽離子也就是 氨基的正電性起到關鍵作用。通過對殼聚糖進行修飾，可W改變氨基的正電性強弱，增強殼 聚糖的殺菌抑菌活性，即對改性的低聚殼聚糖接枝季錠鹽進一步增強制備產物的溶解性并 同時增加抑菌活性中屯、，從而制備一種新型具有多抗菌活性中屯、的抑菌劑。
[0050] 本發明中贓嗦二酬酸具有殺菌抑菌活性。二酬贓嗦類化合物作為一類生物活性很 強的化合物，其結構和活性具有穩定性、新穎性和獨特性等優點，因此在醫藥、食品及天然 產物開發研究等眾多領域中具有廣闊的應用前景，因其可作為活性先導化合物，在尋找蛋 白作用受點、藥物祀點等方面也扮演重要角色。近年來，人們對二酬贓嗦類化合物的結構、 功能等都開始有了逐步的了解，且從動植物及海洋微生物，尤其是海綿共棲細菌中提取、分 離到的二酬贓嗦類化合物的數量也逐年增加，由于其結構新穎、功能奇特等優點引起眾多 學者的重視。
[0051] 二酬贓嗦類化合物的基本結構是由兩個氨基酸縮合而成的環二膚，因其骨架具有 穩定的六元環結構，且有兩個氨鍵給體和兩個氨鍵受體，使得DKPs具有較強的生物活性和 藥理活性，在藥物化學中成為一個重要的藥效團。近年來從海洋微