F快速標記Cys-Annexin V的方法及其應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明屬于陽Τ顯像領域，具體設及一種1中快速標記切S-Annexin V的方法及其應 用。
【背景技術】
[0002] 細胞調亡(Apoptosis)又稱程序性細胞死亡（Programmed Cell Death,PCD)，是不 同于壞死和意外死亡的、由基因調控的細胞主動性死亡過程。作為細胞生命周期中的重要 組成部分，細胞調亡的過程中伴隨著一系列的生物分子及細胞形態學的改變。其中，細胞膜 脂質雙層中的憐脂酷絲氨酸(PS)由細胞膜內層翻轉至外層，進而暴露于細胞表面，是細胞 調亡早期事件，發生在調亡細胞形態學的改變之前，也是調亡級聯反應的初始事件。的外 翻作為調亡細胞被吞隧細胞識別的標志，將會進一步引起胞漿的皺縮、染色質的濃集及核 內DNA降解等現象。因此，外翻的PS作為調亡檢測的祀點，具有較高的時效性，可早期檢測細 胞調亡。目前，在利用檢測外翻的PS來獲知細胞調亡情況的技術中，正電子斷層顯像 (positron emission tomogra地y，陽T)是常用的技術手段之一，其主要是利用iiC、i3N、i5〇 或1中等放射性核素標記的、可與PS特異性結合的物質作為顯像劑，通過顯像劑在代謝中聚 集與分布的呈像，來獲知細胞調亡的情況，從而達到診斷的目的。
[0003] 在可與PS特異性結合的物質中，WAnnexin V作為PET顯像劑的相關技術具有良好 的應用前景。Annexin V(膜聯蛋白V，又稱Annexin A5和AnxA5)是一種人體內源性蛋白，屬 于化依賴性憐脂結合蛋白家族，含有319各氨基酸，包括70-80個氨基酸重復單元，分子量 約為35kD。研究表明，Annexin V與PS特異性結合的親和力高達l(T9mol/L，其在被放射性核 素標記、進而作為PET顯像劑進行體內細胞調亡的顯像時，可實時監測體內調亡的發生并且 可實現細胞調亡的活體無創顯像，因此，已成為監測活體細胞調亡領域的研究熱點。在對 Annexin V進行正電子核素標記的技術中，1^1中標記Annexin V的"F-SFB-AnnexinV最為常 見。但是，由于"F-SFB-Annexin V是通過功能基團（"F-SFB)連接Annexin V中賴氨酸殘基 上的氨基，進而標記上放射性核素的，而一分子的Annexin V蛋白中含有21個賴氨酸殘基， 因此，isF-SFB標記在Annexin V上的位置是不確定的，甚至標記上的個數也不確定。另外， Annexin V中的一些賴氨酸殘基處在Annexin V與PS結合的活性區域附近，i8F-SFB與該處的 賴氨酸殘基連接則會影響Annexin V與PS的親和性。運些均會導致1中-SFB-Annexin V在細 胞調亡顯像時特異性較低。
[0004] 為實現對Annexin V的定位標記，且不影響Annexin V與PS的親和性，進而提高 Annexin V調亡顯像的特異性，現有技術中出現了對Annexin V進行修飾，研究新的Annexin V蛋白變體的相關技術。例如，2008年Li，Xuehe等用isF-FBABM對N端接一個半脫氨酸的 Annexin V蛋白進行標記，研究結果顯示，Annexin V經上述修飾后不影響其與PS結合的親 和力，但是"F-FBABM與蛋白的標記率比較低，僅為37 %，無法實現更為高效標記。
[0005] 為解決上述問題，中國專利文獻CN104193820A中公開了一種1中標記切S-Annexin V的方法及其應用，其中采用1中定位標記的輔助基團是N-[2-(4-[i8F]氣苯甲酯氨基）乙基] 馬來酷亞胺(i8F-F肥Μ)標記切s-Annexin V，然而isF-FBEM合成步驟復雜，合成時間長達2小 時左右，而且由于標記的輔助基團1SF-F邸Μ的脂溶性大，導致其不易溶于蛋白溶液中，不利 于該標記輔基與蛋白溶液中的切s-Annexin V進行反應，影響切s-Annexin V的標記，使得 所述Cys-Annexin V的標記率低，標記所用時間長，效率低。
【發明內容】
[0006] 因此，本發明要解決的技術問題在于克服現有技術中的1中定位標記切S-Annexin V的標記率低，標記時間長，效率低的缺陷，從而提供一種標記率高、標記時間短、效率高的 1申快速標記切s-Annexin V的方法與應用。
[0007] 為此，本發明提供了一種"F快速標記切S-Annexin V的方法，采用"F-Al-NOTA- Maleimide標記Cys-Annexin V。
[000引所述的方法，包括如下步驟：
[0009] (1)取含"F的溶液，加入含有A1C13的緩沖溶液和含有NOTA-maleimide的溶液，混 合均勻，于80-100°C下加熱5-20min，即得含有所述i8F-Al-NOTA-Maleimide的溶液，然后進 行純化，備用；
[0010] (2)取步驟（1)中純化后的所述"F-Al-NOTA-Maleimide溶液，加入到含Cys- Annexin V的緩沖溶液中，混合均勻得到反應液，將所述反應液置于35-37Γ下水浴反應至 生成具有如i8F-A1-N0TA-切S-Annexin V所示結構的標記產物。
[0011] 所述"F-A1-N0TA-切s-Annexin V也可W表示為"F-A1F-N0TA-切s-Annexin V。 [0012]優選的，所述的方法，包括如下步驟：
[OOU] (1)取含"F的溶液，加入含有A1C13的緩沖溶液和含有NOTA-maleimide的溶液，混 合均勻，于90°C下加熱lOmin，即得含有所述標記前體i8F-Al-N0TA-Maleimide的溶液，然后 進行純化，備用；
[0014] (2)取步驟（1)中純化后的所述1 8F-A 1 -NOTA-Ma 1 e imi de溶液，加入到含Cy S - Annexin V的緩沖溶液中，混合均勻得到反應液，將所述反應液置于36°C下水浴反應20- 40min，即得如"F-A1-N0TA-切s-Annexin V所示結構的所述標記產物。
[0015] 所述步驟（1)中，將制備的所述i8F-Al-N0TA-Maleimide溶液采用制備型HPLC法進 行純化，色譜條件為：制備型反相C18柱，W含質量濃度為0.05%-0.3%Ξ氣乙酸和質量濃 度為5 % -20 %的乙臘溶液為流動相進行洗脫，流速為1.5-5血/min，檢測波長為210-230皿， 收集出峰時間為8-13min下流出的組分，即為純化后的所述i8F-Al-N0TA-Maleimide溶液。
[0016] 優選的，所述步驟（1)中，還包括將制備的所述18F-Al-N0TA-Maleimide溶液采用制 備型HPLC法純化的步驟，色譜條件為:制備型反相C18柱，W含質量濃度為0.1%Ξ氣乙酸的 質量濃度為10 %的乙臘溶液為流動相進行洗脫，流速為2mL/min，檢測波長為220nm，收集出 峰時間為12.34min下流出的組分，即為純化后的所述i8F-Al-N0TA-Maleimide溶液。
[0017] 所述的方法，所述步驟(1)中，加入的所述含1中的溶液、所述含有A1C13的緩沖溶液 和所述NOTA-Maleimide溶液的體積比例為1:1:1，其中所述NOTA-Maleimide的濃度為3- lOmg/mL，所述含有A1C13的緩沖溶液中A1C13的濃度為5-15mg/mL。
[001引所述的方法，所述步驟（2)中，所述1咕-41-^了4-]\1曰16；[1111(16溶液與所述〔73- Annexin V溶液的體積比為1:1-10，所述切s-Annexin V的濃度為0.2-20mg/mL，所述"F-A；L- NOTA-Ma 1 e imi de溶液的放射性活度為1 -1 OOOMBq/mL。
[0019]優選的，所述含有A1C13的緩沖溶液中A1C13的濃度為lOmg/mL所述NOTA- Maleimide的濃度為7mg/ni;所述Cys-Annexin V的濃度為lOmg/mL。
[0020] 優選的，所述18F-Al-N0TA-Maleimide溶液的放射性活度為500MBq/mL。
[0021] 所述的方法，所述含有AICI3的緩沖溶液為醋酸鹽緩沖液、憐酸鹽緩沖液或巧樣酸 鹽緩沖液中的一種或幾種的混合液;所述含切s-Annexin V的緩沖溶液為水、醋酸鹽緩沖 液、憐酸鹽緩沖液或巧樣酸鹽緩沖液中的任意一種或幾種的混合液；所述含N0TA- maleimide的溶液為乙臘、乙醇或水。所述含A1C13的緩沖溶液抑值為3-5,抑值優選為4。所 述含Cys-Annexin V的緩沖溶液抑值為6-8，pH值優選為7。
[0022] 優選的，所述含有A1C13的緩沖溶液為乙酸鋼-乙酸緩沖液，濃度為0.2-0.5mol/L， pH值在3-5范圍內。
[0023] 所述NOTA-maleimide的中文名稱為馬來酷亞胺基乙基酷胺單1，4,7-Ξ氮雜環壬 燒-1，4,7-Ξ乙酸。
[0024] 所述的方法，還包括采用緩沖液調節混合均勻的所述i8F-Al-N0TA-Maleimide和含 切s-Annexin V的溶液的混合液即反應液的抑值至5-9的步驟。優選的，所述緩沖液為憐酸 鹽緩沖液或巧樣酸鹽緩沖液中的一種或兩種的混合液。
[0025] 本發明提供了一種由上述的方法制備得到的標記產物i8F-A^N0TA-切s-Annexin V。
[0026] 本發明提供了一種所述的iSp-Al-NOTA-切s-Annexin V在制備陽T顯像劑中的應用
[0027] 本發明還提供了一種陽T顯像劑，包括標記產物"F-A1-N0TA-切s-Annexin V。
[0028] 本發明技術方案相比現有技術，具有如下優點：
[00巧](1)本發明所述的"F快速標記Cys-Annexin V的方法，采用"F-Al-NOTA- Maleimide標記切s-Annexin V，首先，Annexin V的Ξ維結構顯示，其N-端和C-端都位于分 子膜結合點的對面，在重組過程中對Annexin V的兩端進行修飾并不影響重組蛋白在 Escherichia colli的表達或折疊，也不改變其與膜PS結合的親合性，因此，在Annexin V的 C-末端添加1個半脫氨酸得到的切s-Annexin V，其與PS結合的親合性并未受到影響，與此 同時，經過修飾得到的切s-Annexin V可與所述標記前體1中-4^側了4-]\1曰16；[1]11(16的基團實 現高選擇性的連接，Cys-Annexin V的C端的游離琉基與所述標記前體"F-Al-NOTA- Maleimide上的雙鍵發生特異性連接，可較好的保證正電子顯像核素1中的定位標記，避免了 標記位置、標記數量的不確定帶來的顯像特異性低的問題，同時顯著提高了標記率，大大縮 短了標記時間，提高了標記效率，解決了現有技術中的正電子顯像核素1中定位標記Cys- Annexin V的標記率低，標記時間長，效率低的問題；
[0030] 雖然現有技術中i8F-F邸M-切s-Annexin ￥，1中斗邸1也是定位標記切3-4]1]1糾;[]1￥ 半脫氨酸上游離的琉基，但是從"F離子到isF-FBEM-切s-Annexin V的標記時間大約120分 鐘，而本發明從1中離子到i8F-A1-N0TA-切S-Annexin V的標記時間約為60分鐘，與現有技術 相比，本發明的標記時間大大縮短，操作