一種牛樟芝提取物、其用途，以及由其所得的藥物組合物和保健品的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及制藥領域，具體設及一種牛精芝提取物、其用途，W及由其所得的藥物 組合物和保健品。
【背景技術】
[0002] 肝癌是臨床上常見的消化系統惡性腫瘤之一，其中90 %為肝細胞肝癌 化epatocellula;rca;rcinoma，HCC)，在世界范圍內，其發病率呈現上升的趨勢。我國是肝癌 大國，也是全球肝癌發病率最高的國家，據統計，目前我國肝癌發病人數占全球的55%，而 死亡人數約占全世界肝癌死亡人數的45%，素有"癌中之王"的稱號，對我國人民健康構成 了嚴重威脅。肝癌的分子學發病機制尚不完全清楚，肝癌的發生發展是一個多基因參與、通 過不同基因在不同時相的差異表達而進行調控的復雜過程。肝癌治療方法和效果有限，常 用的外科手術切除的方法常存在著不能徹底切除及術后復發等危險，同時肝癌對于放化療 均不敏感，介入手術W及射頻消融等手段也存在著一定的弊端。因此尋找針對肝癌的新的 治療方式十分必要。
[0003] microRNA是一類內源性的短鏈非編碼RNA，在人類的基因組中廣泛存在，大量的研 究工作表明，它們在腫瘤的發生發展，特別是腫瘤侵襲轉移等過程中都發揮了重要作用。 hsa-miR-122是肝臟高表達的一個miRNA，占肝臟miRNA的70%，調節膽固醇代謝的同時對丙 肝病毒的復制具有促進作用。研究表明，hsa-miR-122對肝癌的發生發展具有抑制作用，而 在肝癌組織中，其表達下調。hsa-miR-122的敲除會引發肝炎甚至肝癌，外源性給予hsa- miR-122 則可抑制肝癌形成。近年來研究發現，肝臟轉化生長因子 m(TGFm) 可誘發肝癌起 始細胞和促進肝癌發生。在大鼠肝癌發生過程中W及HCCs患者身上，肝臟祖細胞（liver progenitor cells，或LPCs)可檢測到腫瘤起始細胞(Tumor-initiating cell或T-IC)標志 物的共表達，而且TGFm的水平與T-IC標志物的表達量呈正相關，運表明TGFm在T-IC的形 成過程中發揮了重要的作用。
[0004] 牛精芝又名牛精茹，屬于非權菌目、多孔菌科、薄孔菌屬、多年生葦菌類，拉下名為 An化odia camphorata，是1990年才被生化界發表的新種。其生長區域為臺灣山區海拔450- 2000米山林間，只生長在臺灣特有百年W上的牛精樹樹干腐朽的屯、材內壁，或枯死倒伏的 牛精樹木材潮濕表面。由于采集極為不易，加上野生牛精木近年已被政府列為國寶級生物 之一，因此牛精芝產量十分有限，其售賣價格也非常昂貴。研究表明，多糖，祗類，醬體類化 合物，馬來酸及班巧酸衍生物等是牛精芝的主要活性化合物，具有護肝、抗癌、調節免疫、去 過敏、解毒和抗炎等功效。
【發明內容】
[0005] 為進一步開發牛精芝的藥用功能，本發明的目的是提供一種牛精芝提取物。
[0006] 本發明的另一目的是提供所述牛精芝提取物的用途W及包含所述牛精芝提取物 的藥物組合物及功能性保健品。
[0007]本發明提供的牛精芝提取物如通式(I)所示：
[000引
[0009] 其中，R表示氨或徑基。
[0010] 上述牛精芝提取物的制備過程如下：
[0011] 將牛精芝粉碎，乙醇提取制備總浸膏，然后將總浸膏加水混懸后，依次用石油酸、 乙酸乙醋萃取，取乙酸乙醋部位浸膏，硅膠色譜柱分離，二氯甲燒-甲醇梯度洗脫（1:0,50: 1，30:1，10:1，5 :1，1:1)，得到8個流分，取第4、第6流分，分別為R表示徑基和氨時的上述牛 精芝提取物。
[0012] 本發明還提供了一種牛精芝提取物，其為WC1~巧的脂肪醇提取牛精芝所得的提 取物。
[0013] 優選地，其為W甲醇或乙醇提取牛精芝所得的提取物。
[0014] 上述牛精芝提取物的制備過程如下:將牛精芝粉碎，加入如甲醇、乙醇等低級脂肪 醇加熱回流，反復多次，合并提取液，濃縮即得。
[0015] 本發明還提供了上述牛精芝提取物在制備抑制肝癌的藥物中的用途。
[0016] 所述抑制肝癌的藥物可W為任何與肝癌相關的藥物，包括但不限于預防、緩解、治 療或防止復發的藥物。優選為肝癌放化療后防止復發的藥物。
[0017] 本發明還提供了一種用于抑制肝癌的藥物組合物，包含前述牛精芝提取物W及藥 學上可接受的輔料。
[0018] 所述抑制肝癌的藥物組合物可W為任何與肝癌相關的藥物組合物，包括但不限于 預防、緩解、治療或防止復發的藥物組合物。優選為肝癌放化療后防止復發的藥物組合物。
[0019] 所述藥物組合物可W單獨施用，也可W與現有的藥物配合施用。其可W制備成現 有藥學領域的任何常見劑型，包括但不限于:片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑等口服劑型W及注 射劑、凍干劑等非口服劑型。
[0020] 所述藥學上可接受的輔料可W為現有藥學領域的任何常見種類，包括但不限于： 賦形劑、粘合劑、潤滑劑、填充劑、崩解劑、乳化劑、穩定劑、著色劑、矯味劑、防腐劑等。
[0021] 所述藥物組合物可W單獨使用，也可W與現有的肝癌治療相關的藥物或保健品配 合使用。
[0022] 本發明還提供了一種用于抑制肝癌的功能性保健品，其包含前述的牛精芝提取 物。
[0023] 所述抑制肝癌的保健品可W為任何與肝癌相關的功能性保健品，包括但不限于預 防、緩解、治療或防止復發的功能性保健品。優選為肝癌放化療后防止復發的功能性保健 品。
[0024]除牛精芝提取物作為活性成分外，還可W添加常見配料，包括但不限于：營養素、 維他命、礦物質、香料、著色劑、增粘劑、抑調節劑、穩定劑、防腐劑等。所述功能性保健品可 W單獨食用，也可W與現有的藥物或保健品配合使用。
[00巧]本發明提供的牛精芝提取物可提高hsa-miR-122的表達量，而hsa-miR-122通過調 控下游祀基因 TGFPl等發揮作用，具有降低肝癌細胞活力、增強免疫細胞對肝癌細胞的殺傷 作用等功能，從而可起到抗肝癌、防止肝癌復發、延長患者生存期等作用，因而可廣泛應用 于肝癌相關的藥物、保健品等領域，尤其適合用作肝癌放化療后防止復發的藥物、保健品 等。
【附圖說明】
[0026] 圖1為實施例1所得牛精芝提取物總浸膏的液相色譜圖。
[0027] 圖2為化合物A的核磁共振氨譜圖。
[0028] 圖3為化合物A的核磁共振碳譜圖。
[0029] 圖4為化合物B的核磁共振氨譜圖。
[0030] 圖5為化合物B的核磁共振碳譜圖。
[0031] 圖6為對臨床肝癌樣本中hsa-miR-122表達量的檢測結果圖。
[0032] 圖7為hsa-miR-122祀基因巧光素酶報告基因鑒定結果圖。
[0033] 圖8為肝癌患者hsa-miR-122表達量相關生存曲線圖。
[0034] 圖9為肝癌患者TGFm表達量相關生存曲線圖。
[0035] 圖10為牛精芝提取物的肝癌細胞活力檢測結果圖。
[0036] 圖11為牛精芝提取物處理肝癌細胞后hsa-miR-122巧光素酶報告基因鑒定結果 圖。
[0037] 圖12為牛精芝提取物處理肝癌細胞后hsa-miR-122表達量檢測結果圖。
[0038] 圖13為牛精芝提取物與PBMC共同處理肝癌細胞后細胞活力檢測結果。
【具體實施方式】
[0039] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0040] 下述實施例中所用的臨床組織樣本、血液樣本均通過正規途徑從Ξ甲醫院獲得。
[0041] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0042] 實施例1牛精芝提取物的制備
[0043] 將683g牛精芝粉碎成粗粉，分Ξ批，每批化95%乙醇回流提取四次，每次化。合并 提取液，50°C減壓濃縮得總浸膏168g。總浸膏加化水混懸后，依次用化石油酸、化乙酸乙醋 萃取，得乙酸乙醋部位浸膏約120g。該乙酸乙醋部位浸膏經硅膠柱色譜（200~300目，青島 海洋化工有限公司)分離，二氯甲燒-甲醇梯度洗脫（1:〇,50:1，30:1，10:1，5:1，1:1)，得到8 個流分M1-M8。收集M3-M6合并后采用MCI柱色譜(成都科普生物有限公司）分離，得流分MR1- MR4。流分MR2經0DS反相柱(DAI SO公司，日本)及半制備型HPLC柱(YMC 0DS-A，日本)反復純 化，得化合物A(37 Img)。流分MR4經0DS柱反復純化，得化合物B(683mg)。W上未指明來源的 化學試劑均購自北京化工廠。
[0044] 稱取總浸膏1.97mg，溶于Im巧醇中，用0.22μπι微孔濾膜過濾，進樣。
[0045] 儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀；色譜柱：^oiimet巧 C18,5皿，4.6X250mm, Waters;流動相：乙臘(A)-O.l% 甲酸(B);洗脫程序:0-12min，45-55%A，12-17min，55-60% A，17-26min，60-100%