一種從廢棄蛹蟲草培養基中酶解輔助提取蟲草素的方法
【技術領域】
[0001]本發明公開了一種從廢棄蛹蟲草培養基中酶解輔助提取蟲草素的方法，屬于蟲草素制備技術領域。
【背景技術】
[0002]蟲草菌素又稱蟲草素、蛹蟲草菌素，3’-脫氧腺苷，它是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗菌素。其分子量為251.24，熔點230?231°C，溶于水、熱乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，紫外光的最大吸收波長為259nm。蟲草素有抗腫瘤、抗白血病、抗菌、免疫調節、清除體內自由基等多方面的藥理作用。另據報道，蟲草素一方面具有對DNA和RNA合成過程、加RNA和mRNA轉錄后修飾過程及腺苷酸環化酶活化等三方面的抑制作用，另一方面它又能促進細胞分化，重建細胞骨架。蟲草素有降低膽固醇、降血糖、抗感染、抗瘧原蟲、抗蚊蟲的作用，含蟲草素的蟲草發酵液對哮喘及支氣管疾病、腎衰竭病人的腎功能等方面都有良好的輔助治療效果。目前，在國際市場上蟲草素的純品價格為25000美元/g。我國蛹蟲草栽培普遍，但多以菌絲體或子實體的形式入藥，因此，研究蟲草素的提取工藝具有重要的經濟價值和廣闊的市場應用潛力。
[0003]目前，蟲草素主要通過生物合成的方法經由兩條途徑獲得:一是直接從蛹蟲草子實體中提取;二是通過蛹蟲草液體發酵，從發酵液中提取。蟲草素的獲得主要從蛹蟲草子實體中提取，但子實體中含量只有0.2?0.6%，提取效率不高，且生產周期長，因此蟲草素生產成本極高，價格昂貴；另外的蛹蟲草液體發酵對工藝條件要求嚴格，設備投入較大，發酵后產生的廢液處理難度大。
【發明內容】
[0004]本發明主要解決的技術問題:針對目前傳統方法在提取蟲草素的過程中，雖然蛹蟲草子實體中提取和蛹蟲草液體發酵提取均可以得到蟲草素，但是在蟲草子實體中提取中實體含量低，成本極高，導致提取率較低，另外蛹蟲草液體發酵對于工藝調節要求嚴格，設備投入大，且后續產生的廢液處理難度大的現狀，提供了一種以廢棄蛹蟲草培養基為原料，首先經高壓處理后經中性蛋白酶酶解，再加熱水滅酶浸提，通過樹脂吸附除雜后透析濃縮，冰浴結晶后凍干，從而得到從廢棄蛹蟲草培養基中酶解輔助提取蟲草素的方法。該方法操作簡便，無需特殊設備，以含有菌絲的廢棄蛹蟲草固體培養基為原料，不僅節約了資源，實現了廢物利用，而且降低了生產成本，最終使得蟲草素提取得率達到0.70?0.80%，蟲草素純度達到99 %以上，適合大規模生產應用。
[0005]為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是:
(1)稱取500?600g廢棄蛹蟲草培養基放入組織粉碎機中以4000?5000r/min轉速粉碎后過50?60目標準篩，將過篩后的培養基碎料放入真空脫氣機脫氣處理15?20min后再經超高壓設備在250?350MPa壓力下保壓I?2h后，得到預處理后的廢棄蛹蟲草培養基碎料；
(2)將上述預處理后的廢棄培養基碎料和蒸餾水按體積比為1:3進行混合后裝入陶瓷酶解罐中，加入酶解底物總質量I?2%的中性蛋白酶，用攪拌棒將底物和蛋白酶混合均勻，并用濃度為0.5mol/L檸檬酸溶液調節pH至5?6，用保鮮膜密封罐口后，放入恒溫箱，在45?55°C下保溫酶解I?2h;
(3 )酶解結束后再向酶解罐中加入底物體積I/2的蒸餾水，再將酶解罐放入油浴鍋中，加熱升溫至100?105°C，進行滅酶處理并保持溫度熱提I?2h，熱提結束后過濾分離得到濾液；
(4)將上述濾液過陽離子型交換樹脂吸附柱，過柱完成后用8?10倍樹脂體積的去離子水進行洗柱并收集洗脫液；
(5)量取400?500mL上述收集得到的洗脫液裝入半透膜制成的透析袋中，再將透析袋呈垂直狀放入體積為IL的玻璃杯中，向玻璃杯中加入無水硫酸鈉粉末使其將透析袋完全覆蓋，靜置脫水濃縮I?2h，得到蟲草素提取濃縮液；
(6)將上述得到的蟲草素提取濃縮液放入旋轉蒸發器中，在40?50°C下繼續旋蒸濃縮15?20min后放置在4?6°C的冰水浴中靜置過夜結晶，過濾得到結晶體后，再用真空凍干機干燥后研磨成粉，過200目標準篩后即得蟲草素成品。
[0006]所述的陽離子型交換樹脂是732型陽離子型交換樹脂。
[0007]本發明的應用方法是:將本發明制得的蟲草素成品通過膠囊儀器，制成蟲草素膠囊，其中每個膠囊中含有I?2g蟲草素，食用時，配以250?300mL溫水送服，每日早晚飯后服用一次，每次服用I?3粒，堅持服用7?14天，可以感覺人體抵抗力得到了提高，有助于延緩衰老。
[0008]本發明的有益效果是:
(1)本發明方法獨特新穎，以含有菌絲的蛹蟲草固體培養基為原料，避免了資源的浪費，降低了生產成本，實現了廢物利用；
(2)本發明工藝簡便，無需特殊設備，使得蟲草素提取得率達到0.70?0.80%，蟲草素純度達到99 %以上，適合大規模生產應用。
【具體實施方式】
[0009]首先稱取500?600g廢棄蛹蟲草培養基放入組織粉碎機中以4000?5000r/min轉速粉碎后過50?60目標準篩，將過篩后的培養基碎料放入真空脫氣機脫氣處理15?20min后再經超高壓設備在250?350MPa壓力下保壓I?2h后，得到預處理后的廢棄蛹蟲草培養基碎料;然后將上述預處理后的廢棄培養基碎料和蒸餾水按體積比為1:3進行混合后裝入陶瓷酶解罐中，加入酶解底物總質量I?2%的中性蛋白酶，用攪拌棒將底物和蛋白酶混合均勻，并用濃度為0.5mol/L檸檬酸溶液調節pH至5?6，用保鮮膜密封罐口后，放入恒溫箱，在45?55 °C下保溫酶解I?2h ；酶解結束后再向酶解罐中加入底物體積I/2的蒸餾水，再將酶解罐放入油浴鍋中，加熱升溫至100?105°C，進行滅酶處理并保持溫度熱提I?2h，熱提結束后過濾分離得到濾液;接下來將上述濾液過陽離子型交換樹脂吸附柱，過柱完成后用8?10倍樹脂體積的去離子水進行洗柱并收集洗脫液;隨后量取400?500mL上述收集得到的洗脫液裝入半透膜制成的透析袋中，再將透析袋呈垂直狀放入體積為IL的玻璃杯中，向玻璃杯中加入無水硫酸鈉粉末使其將透析袋完全覆蓋，靜置脫水濃縮I?2h，得到蟲草素提取濃縮液;最后將上述得到的蟲草素提取濃縮液放入旋轉蒸發器中，在40?50°C下繼續旋蒸濃縮15?20min后放置在4?6°C的冰水浴中靜置過夜結晶，過濾得到結晶體后，再用真空凍干機干燥后研磨成粉，過200目標準篩后即得蟲草素成品。所述的陽離子型交換樹脂是732型陽離子型交換樹脂。
[0010]實例I
首先稱取500g廢棄蛹蟲草培養基放入組織粉碎機中以4000r/min轉速粉碎后過50目標準篩，將過篩后的培養基碎料放入真空脫氣機脫氣處理15min后再經超高壓設備在250MPa壓力下保壓Ih后，得到預處理后的廢棄蛹蟲草培養基碎料;然后將上述預處理后的廢棄培養基碎料和蒸餾水按體積比為1: 3進行混合后裝入陶瓷酶解罐中，加入酶解底物總質量1%的中性蛋白酶，用攪拌棒將底物和蛋白酶混合均勻，并用濃度為0.5mol/L檸檬酸溶液調節pH至5，用保鮮膜密封罐口后，放入恒溫箱，在45 °C下保溫酶解Ih;酶解結束后再向酶解罐中加入底物體積1/2的蒸餾水，再將酶解罐放入油浴鍋中，加熱