一種聯苯菊酯半抗原及其快速檢驗裝置及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物檢測技術領域，尤其設及一種聯苯菊醋半抗原及其快速檢驗裝置 及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 聯苯菊醋(Bifenthrin，BF)，是一種人工合成的擬除蟲菊醋類農藥。由于其具有殺 蟲譜廣，擊倒作用快，持續時間長，強大的胃毒和觸殺作用而廣泛用于棉花、茶樹、果樹、蔬 菜等農業害蟲及白蟻、蛾蟲等衛生害蟲的防治。聯苯菊醋化學性質穩定，進入環境后不易被 分解，其廣泛使用容易引起較大殘留。雖然聯苯菊醋在人體內代謝快，不具有積累的危險。 但研究表明，它具有神經毒害作用，通過影響動物的神經系統和鋼離子通道活性，干擾神經 系統的正常功能。因而，長期低劑量接觸聯苯菊醋將對健康產生嚴重影響。世界衛生組織已 將聯苯菊醋歸類為第2類農藥，即中等毒性/中度危害的類別。世界上多個國家包括中國、美 國、加拿大等先后對農產品中聯苯菊醋殘留做了限量規定，歐盟規定食品中聯苯菊醋限量 為5.Omg/kg。發展快速檢測聯苯菊醋殘留的方法對保證食品安全，確保我國農產品順利出 口具有重要意義。
[0003] 目前對聯苯菊醋的殘留分析主要采用氣相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、氣相色 譜-質譜聯用-負化學離子源法、高效液相色譜法、高效薄層色譜法與酶聯免疫分析方法。儀 器檢測方法具有結果可靠準確、檢測限低等優點。然而，儀器檢測的方法，樣品前處理繁瑣、 時間長，需要經過專業培訓、有豐富經驗的人員操作，檢測費用高，不適合批量樣品的快速 檢測與現場檢測。與儀器檢測相比，酶聯免疫分析方法可同時實現對多個樣品的定性、定量 檢測，檢測成本降低，然而，酶聯免疫方法依然需要有一定經驗的專業人員操作，實驗結果 受外界影響及樣品基質影響較大。
【發明內容】
[0004] 針對W上技術問題，本發明公開了一種聯苯菊醋半抗原及其快速檢驗裝置及其制 備方法，針對現有檢測聯苯菊醋技術的不足，建立一種檢測聯苯菊醋殘留的快速方法，使其 能更加快速、靈敏、簡便地檢測聯苯菊醋殘留，滿足了聯苯菊醋殘留快速檢測的需要，給食 品安全提供重要手段。
[0005] 對此，本發明采用的技術方案為：
[0006] -種聯苯菊醋半抗原，其具有式(1)所示的化學結構式：
[0007]
[000引上述化學結構式的化學名為3-(2-氯-3，3,3-S氣丙締）-2,2-二甲基-環丙烷酸 4'-(3-簇基-丙酷基氨基)-聯苯-3-甲基醋;其分子量為521，其MS母離子峰為522.1;顏色： 淡黃色，其烙點為115-122°C。
[0009] 作為本發明的進一步改進，所述聯苯菊醋半抗原采用W下步驟制備得到：
[0010] 步驟Sl:將功夫酸與氯化亞諷反應，回流蒸干后溶解到氯仿中，冰浴下加入反應物 2對硝基聯苯醇，20~30°C反應3~化，蒸干，過柱純化后得到中間產物2對硝基聯苯醇功夫 酸醋；
[0011] 步驟S2:稱取上述中間產物2對硝基聯苯醇功夫酸醋，溶于無水乙醇中，加入氯化 亞錫，70~80°C回流1~化，蒸干溶劑后純化，得到黃色油狀物，將所述黃色油狀物用無水化 晚溶解后，加入下二酸酢，反應3~化，過硅膠柱純化得到所述聯苯菊醋半抗原。
[0012] 進一步優選的，采用如下反應路線制備聯苯菊醋半抗原：
[0013]
[0014]優選的，制備所述聯苯菊醋半抗原的步驟為：
[001引（1)稱取1.2g功夫酸，如式（2)中的反應物1，向其中加入8ml氯化亞諷，回流化后， 蒸干后得到式(2)中的中間產物1，用氯仿溶解;冰浴下滴加到溶有Ig反應物2的氯仿化晚溶 液中，室溫反應地，蒸干，過柱純化后得到淡黃色結晶物，如式(2)中的中間產物2。
[0016] (2)稱取1.2g上述中間產物2,溶于無水乙醇中，加入1. Og氯化亞錫，75°C回流 1.5h，蒸干溶劑后過硅膠柱純化，得到黃色油狀物，即式(2)中的中間產物3,用無水化晚溶 解后，加入〇.5g下二酸酢，即式(2)中的反應物3,反應地，過硅膠柱純化得到聯苯菊醋半抗 原，即式(2)中的半抗原。
[0017] 本發明還公開了一種聯苯菊醋抗原，采用如上所述的聯苯菊醋半抗原制備得到， 利用碳二亞胺法，將所述聯苯菊醋半抗原與載體蛋白偶聯得到聯苯菊醋抗原。
[0018] 進一步優選的，所述聯苯菊醋抗原采用W下步驟制備:將所述聯苯菊醋半抗原與 BSA(牛血清蛋白）溶于pH值為8.5~9.5的碳酸緩沖溶液中，并加入碳二亞胺，攬拌12~24h， 透析純化，得到聯苯菊醋抗原。
[0019] 本發明還公開了一種聯苯菊醋單克隆抗體，采用如上所述的聯苯菊醋抗原與免疫 Balb/c小鼠經細胞融合，篩選得到聯苯菊醋單克隆抗體細胞株，用獲得的聯苯菊醋單克隆 抗體細胞株誘導小鼠產生腹水，純化后獲得聯苯菊醋單克隆抗體。
[0020] 優選的，所述聯苯菊醋單克隆抗體的制備步驟為:取所述聯苯菊醋抗原首次與弗 氏完全佐劑等量混合乳化，第2、3和4次分別與不完全弗氏佐劑等量混合乳化后，免疫BaA/ C小鼠共4次，取小鼠的脾細胞與雜交瘤細胞融合，直接和間接競爭ELISA方法篩選聯苯菊醋 的單克隆抗體細胞株，并用獲得的細胞誘導小鼠產生腹水，純化后獲得聯苯菊醋單克隆抗 體。采用此技術方案，產量大，純度高。
[0021] 本發明還公開了一種聯苯菊醋的快速檢驗裝置，包括反應杯和檢驗試紙，所述檢 驗試紙包括襯板W及襯板上依次粘附包被膜、吸水墊、樣品墊，并使得樣品墊、吸水墊分別 位于包被膜的兩側;所述反應杯里含有如上所述聯苯菊醋單克隆抗體標記的膠體金，所述 包被膜上噴涂有檢測區和質控區，所述檢測區采用如上所述的聯苯菊醋抗原溶液噴制。
[0022] 其中，所述的襯板為不吸水的初性材料，優選硬質塑膠條或不吸水硬紙條;所述的 樣品墊優選玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氣乙締膜或聚醋膜;所述的吸水墊優選吸水能力較 強的吸水濾紙或濾油紙;所述的包被膜優選硝酸纖維素膜或醋酸纖維塑膜。
[0023] 優選的，所述聯苯菊醋單克隆抗體標記的膠體金的制備方法為:將膠體金與所述 聯苯菊醋單克隆抗體混合形成金標抗體，離屯、復溶后得到聯苯菊醋單克隆抗體標記的膠體 金O
[0024] 作為本發明的進一步改進，所述檢測區包括直線式隱形檢測線T線，所述質控區包 括羊抗鼠 IgG溶液噴制的直線式隱形控制線C線，檢測線T線和控制線C線相互平行。優選的， 所述檢測線T線和控制線C線間距至少0.5cm。
[0025] 本發明還公開了一種如上所述的聯苯菊醋的快速檢驗裝置的制備方法，其包括W 下步驟：
[0026] 步驟A:聯苯菊醋半抗原及抗原的制備；
[0027] 將功夫酸與氯化亞諷反應，回流蒸干后溶解到氯仿中，冰浴下加入反應物2對硝基 聯苯醇，室溫反應3~化，蒸干，過柱純化后得到中間產物2對硝基聯苯醇功夫酸醋;稱取上 述中間產物2,溶于無水乙醇中，加入氯化亞錫，75°C回流I~化，蒸干溶劑后純化，得到黃色 油狀物，將所述黃色油狀物用無水化晚溶解后，加入下二酸酢，反應3~化，過硅膠柱純化得 到所述聯苯菊醋半抗原;利用碳二亞胺法將所述聯苯菊醋半抗原與載體蛋白牛血清偶聯， 制備得到所述聯苯菊醋抗原；
[0028] 步驟B:聯苯菊醋單克隆抗體的制備；
[0029] 用所述聯苯菊醋抗原與免疫Ba化/c小鼠經細胞融合，篩選得到聯苯菊醋單克隆抗 體細胞株，用獲得的聯苯菊醋單克隆抗體細胞株誘導小鼠產生腹水，純化后獲得聯苯菊醋 單克隆抗體；
[0030] 步驟C:膠體金，聯苯菊醋單克隆抗體標記的膠體金的制備；
[0031] 用巧樣酸=鋼與氯金酸反應制備膠體金;將膠體金與所述聯苯菊醋單克隆抗體混 合形成金標抗體，離屯、復溶后得到聯苯菊醋單克隆抗體標記的膠體金；
[0032] 步驟D:膠體金反應杯、纖維膜的包被；
[0033] 將步驟C得到的聯苯菊醋單克隆抗體標記的膠體金分裝至微孔反應杯中，低溫干 燥