一種從小葉蓮中提取分離半日花烷型二萜類化合物的方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及醫藥，特別是一種從小葉蓮中提取分離半日花燒型二祗類化合物的方 法及其應用。
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤已經成為當前嚴重影響人類健康、威脅人類生命的主要疾病之一。具有 療程長、難治愈的特點。在世界衛生組織第18屆國際抗癌癥聯盟大會上的一項研究報告表 明，未來20年內新增患病人數將由目前的每年1000萬增加到1500萬，因癌癥而死亡的人數 也將由每年600萬增至1000萬。全球癌癥狀況將日益嚴重，在我國惡性腫瘤死亡率位居全部 疾病死亡率之首。目前臨床上廣泛使用的合成的抗腫瘤藥物普遍存在著毒副作用如脫發、 貧血和胃腸不適等現象。因此加強抗腫瘤藥物的研究，延長患者的生存期，改善患者的生活 質量是藥學工作者的當務之急。中草藥在抗腫瘤方面的應用歷史悠久，從中草藥中尋找高 效低毒的抗腫瘤活性物質，研制選擇性強、毒副作用低的新型抗腫瘤藥物是藥學科研工作 者迫切解決的首要問題。
[0003] 小葉蓮是小築科桃兒屯屬植物鬼白5;[]1〇9〇(1〇地5^1111111 emodi(Wall. )Ying.的干燥 成熟果實。鬼白是一種具有悠久歷史的藥用植物，古代《神農本草經》中就有記載:殺大毒， 療咳嗽喉疾，風邪煩感，失魄妄見。不入湯。W后的歷代本草亦多有記載，主要用于活血散 結、桂風除濕、蟲蛇咬傷、跌打、屯、胃痛、風寒咳嗽、月經不調、鐵棒鍵中毒、風濕筋骨痛及氣 管炎等癥。鬼白分布比較廣泛，我國主要分布在四川、青海、西藏、甘肅、陜西。小葉蓮作為傳 統藏藥始載于《月王藥診》，具有悠久的藥用歷史。化學成分研究表明主要含有木脂素和黃 酬類化合物，而半日花燒型二祗類化合物首次在該屬植物中被發現。本發明所設及的從小 葉蓮中制備半日花燒型二祗類化合物及其抗肝癌和乳腺癌活性，迄今為止未見有專利或文 獻報道。
[0004] 由于生物合成的復雜性，天然產物的結構也復雜多樣。W常規的色譜學方法為主 的分離純化手段往往很難將結構非常相似的天然產物分離開來，而天然產物中混有痕量的 高活性的雜質會導致生物活性的錯誤結論。據相關報道，天然產物熊果酸具有120種生物活 性，有些生物活性在不同的文獻中是完全相反的，如抗菌活性，細胞毒活性。出現運樣結論 的原因是，測試活性所用的熊果酸樣品不是單一的熊果酸化學實體，與其共存的雜質嚴重 影響了活性結果。因此建立完善的天然產物純度評價方法是其準確的生物活性評價的必要 條件。同時高純度的天然產物也是相關藥材質量評價所必須的。因此天然產物的純度評價 是非常重要的。
[0005] 半日花燒型二祗是W十氨糞環合而成的母核為基本骨架的二祗。具有抗炎、抗癌、 保肝利膽、降血糖、抗生育等作用。此類化合物的純度可W通過薄層色譜和高效液相色譜法 測定，運兩種純度鑒定方法不僅需要相應的對照品、操作方法復雜耗時長，而且由于天然產 物特別是半日花燒型二祗類化合物的結構多樣性和復雜性，容易產生誤差。定量核磁共振 氨譜法，由于其操作快速簡便、樣品消耗量少、同時給出定性的結構信息和定量分析結果， 特別是定量核磁共振氨譜法不依賴于被測物的高純度標準品，因此定量分析的成本大大降 低。利用定量核磁共振氨譜法進行半日花燒型二祗類化合物的純度測定是一項非常重要的 研究工作。但至今尚未見到采用定量核磁共振氨譜法測定具有7(8)雙鍵的半日花燒型二祗 類化合物的純度的公開報道。
【發明內容】
[0006] 針對上述情況，為克服現有技術之缺陷，本發明之目的就是提供一種從小葉蓮中 提取半日花燒型二祗類化合物的方法及其應用，可有效解決從小葉蓮中提取分離(制備)半 日花燒型二祗類化合物及純度測定和制備抗乳腺癌、肝癌藥物中的應用問題。
[0007] 本發明解決的技術方案是，所述的從小葉蓮中提取半日花燒型二祗類化合物為 labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dino;r-30-hyh(My-7-labden-13-〇ne(II)，分 子結構式分別為：
[000引
[0009]其制備方法是，將小葉蓮6-9kg用小葉蓮重量2-5倍、體積濃度為75%-95%的乙醇 加熱回流提取3次，提取溫度為90-95°C，提取時間為1.5-2小時，減壓回收乙醇得浸膏狀乙 醇提取物，將乙醇提取物混懸于2-3.化的蒸饋水中，依次W石油酸、二氯甲燒萃取3次，每次 2-3.21^;將二氯甲燒萃取部位上硅膠柱，依次用體積比為100: 0、100: 5、100:7、100:10、100: 30的石油酸-丙酬混合溶劑進行梯度洗脫，每一梯度用10-1化洗脫液，流速為IO-ISmLmirTi, 每200-300ml體積為一流份，收集215個流份，各個流份用GF254薄層板，W體積比1:1的石油 酸-丙酬作為展開劑，W體積比10:90的硫酸-乙醇溶液作為顯色劑，105°C加熱3-5min，進行 硅膠薄層色譜檢測，根據硅膠薄層色譜檢測結果合并流份1-50、51-134、135-178、179-215， 得到組份Fr. 1、組份Fr. 2、組份化.3和組份Fr. 4;將組份Fr. 4上Se地adex LH-20柱，用甲醇 洗脫，流速為1 -2mLmin-i，每5 - IOmL為一流份，收集22個流份，各個流份用GF254薄層板，W體 積比3:1的石油酸-丙酬作為展開劑，W體積比10:90的硫酸-乙醇溶液作為顯色劑，105°C加 熱3-5min，進行硅膠薄層色譜檢測分析，根據硅膠薄層色譜檢測結果合并流份1-4、5-22,得 到亞組份化.4-1、亞組份化.4-2;將亞組份Fr. 4-2經開放ODS柱色譜，用體積比40:60、50: 50、60:40、80:20的甲醇-水作洗脫液進行洗脫，流速為1-SmLmirTi，每3-7ml體積為一流份， 共收集45個流份，各個流份用GF254薄層板，W體積比4:1的二氯甲燒-丙酬作為展開劑，W 體積比10:90的硫酸-乙醇溶液作為顯色劑，105°C加熱3-5min，進行硅膠薄層色譜檢測分 析，分別合并含有目標物labda-7,13-diene-3,15-diol (I)和14,15-dino;r-30-hy化oxy-7-labden-13-〇ne( II)的流份，并分別進行純度測定，得到labda-7,13-diene-3,15-diol (I) 和14,15-dinor-30-hydroxy-7-l曰bden-13-one(II)。
[0010]該方法制備的labda-7,13-diene-3,15-diol (I)和14,15-dino;r-30-hyh〇w-7-Iabden-13-〇ne(II)具有抗乳腺癌、肝癌的活性，實現labda-7,13-diene-3,15-diOI (I)和 14,15-dino;r-30-hyh(My-7-labden-l3-〇ne(II)在制備抗乳腺癌、肝癌藥物中的應用。
[001。 本發明方法穩定可靠，易操作，所得產物經（Ih-醒R、"C-匪R、DEPT、Ih-Ih COSY、 HSQC、麗BC、N0ESY)及高分辨質譜化R-ESI-MS)光譜技術鑒定為半日花燒型二祗類化合物 labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dino;r-30-hyh(My-7-labden-13-0ne(II)，并 對人乳腺癌細胞株MCF-7和人肝癌細胞化pG2具有細胞毒活性，有效用于制備抗乳腺癌、肝 癌藥物，開拓了小葉蓮的藥用價值，是抗乳腺癌、肝癌藥物上的創新，有顯著的經濟和社會 效益。
【具體實施方式】
[0012] W下結合實施例對本發明的【具體實施方式】作詳細說明。
[0013] 本發明在具體實施中可由W下實施例給出。
[0014] 實施例1
[0015] 本發明在具體實施中，是將小葉蓮化g用小葉蓮重量3倍、體積濃度為95%的乙醇 加熱回流提取3次，提取溫度為95°C，提取時間為1.5小時，減壓回收乙醇得浸膏狀乙醇提取 物，將乙醇提取物混懸于3.化的蒸饋水中，依次W石油酸、二氯甲燒萃取3次，每次3.2レ將 二氯甲燒萃取部位上硅膠柱，依次用體積比為100: 0、100:5、100:7、100:10、100:30的石油 酸-丙酬混合溶劑進行梯度洗脫，每一梯度用1化洗脫液，流速為ISmLmirTi，每300ml體積為 一流份，收集215個流份，各個流份用GF254薄層板，W體積比1:1的石油酸-丙酬作為展開 劑，W體積比10:90的硫酸-乙醇溶液作為顯色劑，105°C加熱5min，進行硅膠薄層色譜檢測， 根據硅膠薄層色譜檢測結果合并流份l-50、51-134、135-178、179-215，得到組份Fr.l、組份 Fr. 2、組份Fr. 3和組份Fr. 4;將組份Fr. 4上S邱hadex LH-20柱，用甲醇洗脫，流速為2mLmin -1，每IOmL為一流份，收集22個流份，各個流份用GF254薄層板，W體積比3:1的石油酸-丙酬 作為展開劑，W體積比10:90的硫酸-乙醇溶液作為顯色劑，105 °C加熱5min，進行硅膠薄層 色譜檢測分析，根據硅膠薄層色譜檢測結果合并流份1-4、5-22,得到亞組份Fr.4-1、亞組份 化.4-2;將亞組份化.4-2經開放ODS柱色譜，用體積比40:60、50:50、60:40、80:20的甲醇-水 作洗脫液進行洗脫，流速為3mLmin-i，每7ml體積為一流份，共收集45個流份，各個流份用 GF254薄層板，W體積比4:1的二氯甲燒-丙酬作為展開劑，W體積比10:90的硫酸-乙醇溶液 作為顯色劑，105 °C加熱3min，進行硅膠薄層色譜檢測分析，分別合并含有目標物labda-7， 13-diene-3,15-diol (I)和14,15-dino;r-30-hyh(My-7-labden-13-〇ne (II)的流份，并分 別進行純度測定，得到labda-7,13-diene-3,15-diol (I)和14,15-dino;r-30-hyh〇w-7-labden-13-one(II)。
[0016] 實施例2
[0017] 本發明在具體實施中，也可將小葉蓮化g用小葉蓮重量5倍、體積濃度為75%的乙 醇加熱回流提取3次，提取溫度為92°C，提取時間為1.8小時，減壓回收乙醇得浸膏狀乙醇提 取物，將乙醇提取物混懸于化的蒸饋水中，依次W石油酸、二氯甲燒萃取3次，每次化;將二 氯甲燒萃取部位上硅膠柱，依次用體積比為100:0、100:5、100:7、100:10、100:30的石油酸-丙酬混合溶劑進行梯度洗脫，每一梯度用IOL洗脫液，流速為IOmLmirTi,每200ml體積為一流 份，收集215個流份，