用于治療癌癥和病毒感染的免疫受體調節的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及免疫受體CD96。更具體地，本發明涉及CD96的抑制，從而提高免疫系統 靶向腫瘤和其它能逃逸免疫系統的疾病或病癥的能力。
【背景技術】
[0002] 有效免疫應答的進展需要通過若干免疫的檢查點。通路可能需要興奮性共刺激信 號的存在，或者負面的或共抑制信號的逃避，負面的或共抑制信號作用于降低或終止免疫 活性。免疫球蛋白超家族在這種免疫應答的協調中占據著核心重要地位，并且⑶28/細胞毒 T淋巴細胞抗原-4((：11^-4):87.1/87.2受體/配體組合代表了這些免疫調節因子的原型實 例。這些檢查點的部分作用是監視不需要的和有害的自主(self-directed)活性的可能性。 雖然這是一種必要的功能，有助于自體免疫的預防，但是它可能充當旨在靶向惡性的自體 細胞的成功的免疫治療的障礙，其中惡性的自體細胞主要顯示與它們所衍生來自的細胞相 同的表面分子陣列。旨在克服這些外周耐受機制的治療，特別是通過封閉在T細胞上抑制性 檢查點，提供了產生抗腫瘤活性的潛力，或者作為單一治療或與其它治療協同作用，直接或 間接的提高腫瘤表位提呈至免疫系統。此種抗T細胞檢查點的抗體在晚期人類癌癥的早期 臨床試驗中顯示出前景。
[0003] 此外，自然殺傷(NK)細胞是限制早期腫瘤生長和轉移的關鍵的先天（innate)淋巴 細胞、NK細胞功能同樣是通過廣泛的激活和抑制受體的信號傳遞的整合來調節 2。例如，病 原體來源的或壓力誘導的配體被激活受體如NCRs、NKG2D、或DNAM-1識別，刺激NK細胞細胞 毒性和促炎介質的分泌，如干擾素 γ (IFN-γ )3。相反地，抑制性受體保護靶細胞免受NK細 胞介導的殺傷4。這些受體主要地識別MHC I類和MHC I類相關分子，以及包括KIR(殺傷細胞 免疫球蛋白樣受體)和LIR(白細胞免疫球蛋白樣受體)家族，小鼠中Ly49家族和在兩物種中 的CD94/NKG2異二聚體。
[0004]最近已描述了免疫球蛋白超家族成員的新出現的組與粘連蛋白和粘連蛋白樣 (necl)家族的配體相互作用，影響NK細胞和T細胞功能5。這些包括CD226(DNAM-1)6、CD96 (TACTILE) 7、TIGIT(T細胞免疫球蛋白和Ι??Μ結構域)8'9、和CRTAM(I類限制性T細胞相關分 子） 1(\DNAM-1和TIGIT是該家族最廣泛研究的成員，并且它們共享共同的配體，CD 155 (1^(：1-5;?￥10和〇)112(粘連蛋白-2;?￥此2) 8'11。1'1611'還結合額外的配體〇)113(?￥此3)8。據 報道，在NK細胞上DNAM-1和TIGIT的功能是平衡的（counter-balancing) 12。在體外，DNAM-1 加強NK細胞對廣泛的腫瘤細胞的細胞毒性13，14,并且在體內對腫瘤的免疫監視至關重 要 13'15'16。相反地，!'1611'攜帶11'頂基序，并且已經提出與抑制性1^49或1(11?與冊1(：1類分子的 相互作用相似地防止自體組織損傷 17。確實，在體外⑶155結合(engagement )TIGIT已經顯示 了限制IFNy產生和NK細胞的細胞毒性18'19。然而在體內，NK細胞生物學中TIGIT的作用相對 于其它粘連蛋白受體DNAM-1和⑶96仍有待評估。
[0005] 盡管在20年前已被克隆7,關于⑶96,與DNAM-1和TIGIT共享⑶155配體的其它Ig家 族成員，所知甚少2Q，21。在人類中，CD96表達主要局限于NK細胞、CD8T細胞、和⑶4T細胞 7。 ⑶96的主要配體是⑶155，但是還有報道⑶96與⑶111 (粘連蛋白-1)有關，并且在促進NK和T 細胞粘附中起作用21，22。
【發明內容】
[0006] 出人意料地，本發明人已經發現了⑶96充當Τ細胞和ΝΚ細胞抗腫瘤功能的負調節 因子。相應地，本發明廣泛涉及試劑的用途，所述試劑至少部分封閉或抑制CD96,從而減少 或緩解CD96介導的免疫抑制，在哺乳動物中提高或恢復免疫監視。在某些實施方案中，這可 促進至少對CD96部分封閉或抑制應答的疾病或病癥的治療，例如癌癥和/或病毒感染。
[0007] 在第一方面中，本發明提供了一種在哺乳動物中減少或緩解免疫抑制的方法，所 述方法包括在一種或更多種哺乳動物的細胞中至少部分抑制或減少CD96活性的步驟，從而 在哺乳動物中緩解免疫抑制以及或提高或恢復免疫監視。
[0008] 適當地，在哺乳動物中抑制或減少CD96活性的步驟不包括或至少不依賴于殺傷哺 乳動物中表達CD96的細胞。優選地，在哺乳動物中抑制或減少CD96活性的步驟包括在一種 或更多種表達CD96的哺乳動物的細胞中抑制或減少CD96結合CD155和/或細胞內信號傳導。
[0009] 在一個具體的實施方案中，在哺乳動物中抑制或減少CD96活性的步驟包括增加或 提高一種或更多種細胞因子或趨化因子的表達、產生和/或分泌。優選地，所述細胞因子是 干擾素 γ (IFN-γ )。典型地，一種或更多種哺乳動物的細胞是Τ細胞，包括⑶4+和⑶8+Τ細胞、 γδΤ細胞、ΝΚΤ細胞、以及自然殺傷(ΝΚ)細胞。
[0010] 在一個優選的實施方案中，所述方法在哺乳動物中緩解免疫抑制和/或提高或恢 復免疫監視，從而在哺乳動物中治療或預防癌癥或癌癥轉移。
[0011] 在其它實施方案中，所述方法在哺乳動物中緩解免疫抑制和/或提高或恢復免疫 監視，從而在哺乳動物中治療或預防病毒感染。
[0012] 在第二方面中，本發明提供了一種篩選、設計、工程化或者生產CD96抑制試劑的方 法，所述方法包括測定候選分子是否能夠至少部分抑制或減少CD96活性、從而在哺乳動物 中緩解免疫抑制和/或提高或恢復免疫監視的步驟。
[0013] 在第三方面中，本發明提供了一種根據第二方面的方法篩選、設計、工程化或者生 產的⑶96抑制試劑。
[0014] 在一個實施方案中，所述CD96抑制試劑是抗體或抗體片段。
[0015] 在一個具體地實施方案中，所述⑶96抑制試劑是一種抗癌癥試劑。
[0016] 在另一個具體地實施方案中，所述⑶96抑制試劑是一種抗病毒試劑。
[0017] 在第四方面中，本發明提供了根據本發明第三方面的CD96抑制試劑，其用于根據 本發明第一方面的方法。
[0018] 適當地，根據上述的方面，所述哺乳動物是人類。
[0019] 除非文中另有要求，術語"包括（compr i se )"、"包含（compr i ses )"和"含有 (comprising)"、或類似術語旨在表示非排他性的包括，如此要素和特征的列舉不僅包括闡 明的或列舉的要素，但可能包括其它未列舉或闡明的要素或特征。
[0020]本文所使用的不定冠詞"一個(a)"和"一種(an)"指的是包含單數或復數要素或特 征，并且不應作為表示或定義為"單一 (one)"或"單獨(single)"要素或特征。
【附圖說明】
[0021] 圖1:⑶96與DNAM-1競爭結合⑶155。&、13通過流式細胞術分析所示的來自C57BL/ 6WT(淺灰)和⑶96 v_小鼠（深灰）的脾淋巴細胞群的⑶96的表達。顯示來自3個實驗中的一個 代表性實驗的3只小鼠的代表性FACS柱狀圖（a)和平均值±50卬）。(：、(1在新鮮分離的或使用 IL-2(1000U/ml)激活48小時的野生型脾NK細胞上測定CD96、DNAM-1和TIGIT的表達。e.通過 流式細胞術，在所示的濃度評估偶聯有AF-647的小鼠 CD 155-Fc與新鮮分離自WT、CD96+、 DNAM-l+SDNAM-r/TDgel小鼠的純化的NK細胞的結合。f.在存在抗⑶96和或抗DNAM-lmAb時，在純化的WT NK細胞上分析偶聯有AF-647(10μg/ml)的CD155-Fc的結合。g.在存在 50μg/ml的對照Ig、重組CD96或TIGIT-Fc時，分析在BMDC的細胞表面上標記有AF-647(0.5-l〇μg/ml)的DNAM-1-Fc的結合。c-g.顯示來自至少3個實驗中的一個代表性實驗的一式三份 的孔的代表性FACS柱狀圖和平均值土SD。林*ρ〈0·001，Τ檢驗(Student T text)。
[0022] 圖2:CD155結合CD96調節NK細胞IFNy的產生。CD96結合CD155-Fc限制通過外源性 細胞因子(a、b、d)和NK細胞受體(c)誘導的NK細胞IFN-γ的產生。a、b、d.使用包被有或沒有 CD155-Fc(0.5yg/孔）的板，我們分析了在存在或不存在抗CD96抗體(50μ/πι1)時，新鮮純化 的CD96- Λ、TIGIT-Λ和WT ΝΚ細胞對IL-12(25-100pg/ml)和IL-18(50ng/ml)應答細胞內產生 的IFN- γ。c.使用包被有抗NK-1.1 (2.5yg/孔)和CD155-Fc(0.5yg/孔）的板，我們分析了被 IL-2激活的來自⑶96-Λ和WT小鼠的NK細胞細胞內產生的IFN- γ。顯示來自3個實驗中的一 個代表性實驗的一式三份的孔的代表性FACS柱狀圖（a)和平均值土 30(13、〇、(1)。邙〈0.05、** ρ〈0·01、***ρ〈0·001，Τ 檢驗。
[0023] 圖3:CD96限制依賴ΝΚ細胞的腫瘤免疫監視。a、b.CD96和DNAM-1在B16F10轉移的控 制中具有相反的作用。a.2xl05B16F10細胞靜脈注射至WTXDge^'DNAM-r/lPDNAM-r/- CD96+小鼠，并且在14天后定量在肺中的轉移負荷。3個實驗中的代表性實驗。b.圖片顯示 在注射2xl05和5xl0 5B16F10細胞兩周后WT和⑶96v_小鼠的肺。兩個實驗中的代表性實驗。c. 在B16F10細胞表面⑶96和TIGIT與DNAM-1競爭結合⑶155。存在50μg/ml的對照Ig、重組⑶96 或TIGIT-Fc時，分析在B16F10細胞的細胞表面上標記有AF-647(0.5-20μg/ml)的DNAM-1-Fc 的結合。顯示來自3個實驗中的一個代表性實驗的一式三份的孔的代表性FACS柱狀圖和平 均值土 SDd.以所示的效靶比，在B16F10細胞和來自WT、DNAM-1V-和CD96-/―小鼠的IL-2激活 的NK細胞之間進行4小時的 51Cr釋放試驗。實心圓代表WT NK細胞，空心圓代表⑶96V_NK細胞 以及實心方塊代表DNAM-1V_NK細胞。e-h.在NK細胞介導的MCA誘導的纖維肉瘤的免疫監視 中，CD96和DNAM-1具有相反的作用。e-h使用MCA(100yg/小鼠）注射15-30只雄性WT、DNAM-和DNAM-l+CDgel小鼠的組。顯示具有肉瘤的個體小鼠的生存(e-g)和生長曲 線(h)。f.使用如材料和方法中定義的抗⑶96、抗DNAM-1或者抗⑶155mAb處理WT小鼠。g.使 用100yg MCA注射WT和⑶96+小鼠，并且使用對照抗體、抗IFN- γ抗體、或者抗去唾液酸 (&81&1。）6]\11處理。*卩〈0.05]\&1^61-〇31檢驗。
[0024]圖4:抗⑶96mAb具有單獨試劑活性并且提高抗H)1的抗腫瘤應答。使用AT3-0VAdim 腫瘤細胞（106細胞）皮下注射0578176野生型（11')小鼠，并且在第16、20和24天使用抗 CD96mAb(3 · 3，250yg i ·p ·)或者抗PD-1 (RMP1-14，250yg，i ·p ·)腹腔注射處理。顯示每組5只 小鼠的平均值土 SEM(mm2) (*: p〈0 · 05通過Mann-Whitney檢驗與單獨clg對比）。
[0025] 圖5:抗⑶96mAb提高通過阿霉素(D0X)化療產生的抗腫瘤應答。使用AT3-0VAdim腫 瘤細胞（1〇 6細胞)皮下注射C57BL/6野生型(￥1')、0嫩1-1_/_和〇)96_/_小鼠，并且在第14天使 用對照PBS或者D0X (50微升，2mM，瘤內）處理。WT小鼠的一些組還在第12、14、18、21、24和28 天接受抗CD96mAb(3.3，250yg，i . p.)或者抗DNAM-1 (480.1，250yg，i . p.)的腹腔注射。顯示 每組5只小鼠的平均值土 SEM(mm2)。
[0026] 圖6:宿主⑶96缺陷提高阿霉素(D0X)化療的抗腫瘤應答。使用AT3-0VAdim腫瘤細胞 (1〇 6細胞)皮下注射C57BL/6野生型(WT)、DNAM-1V1PCD96V_小鼠，并且在第16天使用對照 PBS或者D0X(50微升，2mM，瘤內）處理。顯示每組5只小鼠的平均值土標準誤(mm2)。
[0027] 圖7:抗⑶96mAb提高由阿霉素(D0X)化療產生的抗腫瘤應答。使用AT3-0VAdim腫瘤 細胞（1〇 6細胞)皮下注射C57BL/6野生型(WT)小鼠，并且在第16天使用對照ros或者D0X(50 微升，2mM，瘤內）處理。WT小鼠的一些組還在第16、20和23天接受抗CD96mAb (3.3，250yg， i . P.)的腹腔注射。顯示每組5只小鼠的平均值土 SEM(mm2) (*: p〈0.05通過Mann-Whitney檢 驗與單獨clg對比）。
[0028] 圖8:早期抗CD96mAb提高由抗PD-1和抗CTLA-4mAb產生的抗腫瘤應答。使用B16-0VA黑色素瘤細胞（105細胞)皮下注射C57BL/6