用于治療hbv感染和相關病癥的結合免疫效應細胞表面抗原和hbv抗原的雙或多特異性多肽的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及多肽，其包含(a)配置為結合第一抗原的第一組的6個互補性決定區域 (CDR);和(b)(ba)配置為結合第二抗原的第二組的6個CDR;或者(bb)能夠結合第二抗原的 配體;其中（i)所述第一抗原選自乙型肝炎病毒(HBV)小表面抗原;HBV中表面抗原;和HBV大 表面抗原;和（ii)所述第二抗原選自由免疫效應細胞如天然殺傷(NK)細胞和細胞毒性T淋 巴細胞(CTL)所呈現的表面抗原。
[0002] 在本說明書中，引用了許多文獻包括專利申請和廠商手冊。這些文獻的公開內容 (當不認為與本發明的專利性相關時）以其整體援引加入本文。更具體的地，所有引用的文 獻都以這樣的程度援引加入，也即如同每個單獨的文獻都是特別并且單獨指定援引加入 的。
【背景技術】
[0003] 大約3.5億人類受到乙型肝炎病毒(HBV)的慢性感染。HBV感染可包含肝硬化和肝 細胞癌（HCC)，其每年導致大約一百萬人死亡（Ganem等人，Hepatitis B virus infection-natural history and clinical consequences.N Engl J Med;350:1118-29 (2004)) ABV的感染目前在約5%的成人患者和約90%的新生兒中不能得到控制。在此種情 形中，HBV感染變成慢性。可能的原因是細胞免疫應答不足。目前可用的用于治療HBV感染的 抗病毒藥物抑制病毒的復制。然而，共價閉合環狀DNA( CCCDNA)保留在受感染肝細胞的細胞 核中并且一旦患者停止攝入藥物就可能引發HBV感染的再次激活。因此，如果要完全治愈感 染則必不可少地要消除攜帶有所述cccDNA的HBV感染細胞(Protzer等人，Nat Immunol Rev 12:2013-213(2012))。
[0004] 然而，HBV感染細胞的此類毒性消除（通過細胞毒性T淋巴細胞或天然殺傷(NK)細 胞)并未發生或者發生的程度不足。
[0005] 攜帶有HBV cccDNA的感染細胞在其表面展現出病毒表面蛋白。即便病毒被釋放至 細胞內囊泡中也同樣如此，因為許多HBV表面蛋白保持整合在內質網的細胞內膜內。在囊泡 轉移的過程中，所述細胞內膜可以與細胞膜融合，結果是HBV表面蛋白展現在感染細胞的表 面。
[0006] Bohne等人（T Cell redirected against Hepatitis B virus surface protein eliminate infected hepatocyte.Gastroenterology; 134:239-247(2008))和Krebs等人 (T cell Expressing a Chimeric Antigen Receptor That Binds Hepatitis B virus Envelope Proteins Control Virus Replication in Mice.Gastroenterology(2013))描 述了嵌合抗原受體，當其通過逆轉錄病毒呈遞并在T細胞表面表達時，能夠促使原代人類和 鼠類T細胞識別展現HBV小表面抗原的肝細胞并且溶解復制HBV的細胞。
[0007] 雙特異性抗體通常應用于腫瘤學領域。作為實例，參見Hartmann等人(Treatment of refractory Hodgkin's disease with an anti_CD16/CD30bispecific antibody. Blood；89:2042-7(1997))〇
[0008] EP 2 524 699A1描述了三功能抗體。這些抗體"具有功能性的Fc部分"并且"必須 由不同亞類的重免疫球蛋白鏈組成"。在另一方面Hornig和:FSrber-Schwarz在"Antibody Engineering"（ed.Patrick Channes，Humane Press，2012)的第40章描述了缺乏Fc部分的 scFv結構。
[0009] Liao等人(Oncology Reports 3,637-644(1996))描述了雙特異性單克隆抗體，其 重新靶向于效應細胞以用以溶解裸鼠中的人類肝癌異種移植物。所描述的雙特異性抗體是 通過兩種雜交瘤的融合而產生的，所述融合導致產生了雜交瘤細胞系表達兩種不同抗體的 重/輕鏈組合。這可以導致兩種不同重鏈的配對，但也可以導致相同重鏈的配對，造成了單 特異性親代和雙特異性抗體的隨機混合物。所述雙特異性抗體含有重鏈和輕鏈并且二聚化 以形成Ig分子(其不是單一多肽鏈）。
[0010] 參考現有技術，可見的技術問題是提供替代的或者改善的措施和方法，用以治療 HBV感染以及由HBV感染所引起的病癥如肝硬化或肝細胞癌癥。以細胞生物學的術語表達， 可見的技術問題是提供用于根除攜有HBV cccDNA的細胞的措施和方法。此類技術問題由所 附的權利要求解決。
【發明內容】
[0011]因此，本發明在第一方面涉及多肽，其包含(a)配置為結合第一抗原的第一組的6 個互補性決定區域(CDR);和(b)(ba)配置為結合第二抗原的第二組的6個CDR;或者(bb)能 夠結合第二抗原的配體;其中（i)所述第一抗原選自HBV小表面抗原;HBV中表面抗原;和HBV 大表面抗原;和（ii)所述第二抗原選自由免疫效應細胞如天然殺傷(NK)細胞和細胞毒性T 淋巴細胞(CTL)所呈現的表面抗原。
[0012] 術語"多肽"定義了氨基酸的縮聚物分子，其形成具有一個N-末端和一個C-末端的 單一的鏈。其成分氨基酸包括20中天然存在的成蛋白氨基酸。優選地，所述多肽僅由所述天 然存在的成蛋白氨基酸所構成。有鑒于此，該術語延伸至這樣的分子，其在所述天然存在的 成蛋白氨基酸之外，還含有高達20%、10%、5%、2%、或1%的選自以下的氨基酸:非天然存 在的α_氨基酸、β_氨基酸、D-氨基酸、硒代半胱氨酸、硒代甲硫氨酸、羥基脯氨酸、吡咯賴氨 酸和鳥氨酸。還應理解一或多個氨基酸(如2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸)可以是磷酸化 的。后者特別適用于絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸。還可以存在其它本領域已知的翻譯后修飾， 包括糖基化。糖基化包括Ν-連接糖基化(通常在天冬酰胺處)和0-連接糖基化(通常在絲氨 酸或蘇氨酸殘基處）。1和/或C-末端可以得到保護，保護基團包括用于Ν-末端的乙酰基和 用于C-末端的胺。所述多肽中所包含的氨基酸之間的連接類型局限于酰胺(C0NH)鍵。術語 "酰胺鍵"包括肽鍵，其將給定氨基酸的羧基連接至隨后氨基酸的α_氨基。所述"酰胺鍵" 還擴展至異肽鍵，其是不出現在多肽主鏈上的酰胺鍵。例如，涉及的可以是賴氨酸的側鏈氨 基而非α_氨基。類似地，涉及的可以是谷氨酸或天冬氨酸的側鏈羧基而非α-羧基。涵蓋了存 在一個或多個異肽鍵，如2、3、4、5、6、7、8、9或10個異肽鍵。但是優選其中的成分氨基酸僅僅 通過肽鍵彼此連接的多肽。
[0013] -般而言，多肽中氨基酸的數目沒有上限。如序列表中所包含的示例性多肽序列 所示，本發明的多肽通常含有幾百個氨基酸，優選250至1000個、400至900個、或者700至800 個氨基酸。通常會區分一方面的肽和另一方面的多肽，其中肽具有30個或更少的氨基酸而 多肽具有超過30個氨基酸。
[0014]術語"互補性決定區域"，縮寫為"CDR"具有本領域已知的含義。這些是短的亞序 列，通常范圍在大約3至大約25個氨基酸，其賦予抗體特異性識別抗原表位的能力。一般而 言，抗體輕鏈的可變結構域提供3個CDR，以及抗體重鏈的可變結構域提供3個CDR。雖然CDR 通常是免疫球蛋白結構域的部分，但本發明在這一方面并無要求。只要是包含所述CDR的氨 基酸序列就夠了，前提是所述氨基酸序列當在生理條件下折疊時能夠以空間接近性呈現所 述CDR，并且保持其識別同族抗原的能力。所提到的空間接近性以及結合抗原的能力在用于 上文所公開的主要實施方案中時，表述為術語"配置為結合抗原"。術語"免疫球蛋白結構 ±或"是本領域已知的，并且是指通常70至100個氨基酸的序列（呈現出7至9個反平行β-鏈的 2-層夾心三維結構）。
[0015]所述第一組的6個⑶R以及所述第二組的6個⑶R每個均限定了結合位點。
[0016]應理解在所述第一組和第二組之外，本發明的多肽中不存在另外的⑶R。
[0017]術語"抗原"具有本領域已知的含義。其是指一組6個CDR(通常由免疫球蛋白結構 域呈現)特異性地識別并結合的分子。所述CDR識別并結合的抗原特定部分已知為表位。
[0018] 術語"配體"具有本領域已知的含義。配體是受體的對立結構。更具體地，配體能夠 結合(優選特異性結合)其同族受體。根據本發明，所述配體優選是免疫配體。免疫配體是能 夠結合免疫效應細胞表面上所呈現的受體的配體。優選的免疫效應細胞有（如上文所述 的），ΝΚ細胞和CTL。優選的是這樣的免疫配體，當結合至免疫效應細胞表面的其同族受體 時，其會發揮刺激和/或共刺激效應。術語"激活"和"刺激"在此種背景下等價使用。優選的 免疫配體所結合的受體在下文做進一步詳述。
[0019] HBV S/M/L表面蛋白是HBV外包膜中的小、中和大表面抗原（Stibbe，W.，和 ff.H.Gerlich. Structural relationships between minor and major proteins of hepatitis B surface antigen.J.Virol.1983 46:626-628)〇
[0020] 三個HBV表面抗原由一個閱讀框轉錄和翻譯，且彼此的差別是N-末端部分的長度。 因此，所述大表面抗原包含中和小表面抗原中都不存在的部分，以及所述中表面抗原包含 小抗原中不包含的部分(但包含在大抗原中）。所述小抗原由這樣的序列組成，其包含在中 和大抗原的C-末端部分。
[0021] 所述大HBV表面抗原可以兩種方式插入到細胞質膜中。N-末端或者C-末端可以位 于胞外側。兩種配制在HBV感染的細胞中都有發現。
[0022] 所提到的第二抗原是由免疫效應細胞呈現的表面抗原，優選是特異性地由NK細胞 和/或CTL所呈現的。免疫效應細胞是要重新導向HBV感染細胞的細胞，所述HBV感染的細胞 在其表面呈現所提到的HBV表面抗原。
[0023] 特別優選的是，本發明的結合是特異性的，特別是CDR和抗原之間的結合以及配體 和抗原之間的結合。術語"特異性地結合"和"特異性結合"（與"特異性相互作用"具有相同 含義)如本發明中所用是指，這些結合部分不會(或基本上不會)與類似于靶標抗原的表位 或結構交叉反應。可以對所研究的一組分子的交叉反應性進行測試，例如，通過評估該組分 子在常規條件下對感興趣表位的結合，以及其對一些或多或少(結構上和/或功能上)緊密 相關的表位的結合。只有在其相關背景中結合感興趣的表位(例如蛋白結構中的特定基序） 但卻不會或基本不會結合任何其它表位的那些分子才會被認為對感興趣的表位是特異性 的。
[0024]第一方面包含這樣的實施方案，其中條目（a)和(ba)-起是所述多肽上呈現的僅 有的結合位點，以及包含這樣的實施方案，其中條目（a)和(bb)-起是所述多肽上呈現的僅 有的結合位點。
[0025]慢性HBV感染特征在于免疫耐受狀態。更具體的地，在患者的CTL和NK細胞的作用 下未發生感染細胞的完全根除或者HBV復制的完全控制或者HBV的完全消除。本發明的多肽 在這樣的意義上而言是雙特異性分子，也即其一方面特異性識別HBV表面抗原而另一方面 特異性識別免疫效應細胞表面抗原。此類雙特異性分子可以視為賦予了針對免疫效應細胞 的人工特異性。事實上，本發明的多肽靶向CTL和NK細胞(也稱作是"雙特異性"）從而其被用 于HBV感染的細胞并將其殺傷。
[0026] -方面本發明的多肽對HBV感染的細胞的結合和另一方面對免疫效應細胞的使用 可以任何順序發生或者也可以同時發生。
[0027] 具體而言，想要通過注射或者作為口服應用形式來全身性地應用本發明的多肽， 并使其能結合HBV-感染的或者表達HBV抗原的靶標T細胞并將所述免疫效應細胞用于所述 靶標T細胞。
[0028] 有鑒于此，還涵蓋了將本發明的多肽與免疫效應細胞(或者包含所述效應細胞的 外周血單核細胞群體)接觸，從而所述效應細胞加載了所述多肽。此類已經在體外或者離體 加載的效應細胞（或包含此類加載的效應細胞的TOMC群體）可以繼而施用于患有HBV感染 (或者與其相關的和下文定義的病癥）的患者。此種施用可以在靜脈內發揮作用，例如肝動 脈。免疫效應細胞(具有結合至所述免疫效應細胞表明抗原的本發明的多肽)也是本發明的 方面。此方面在下文中進一步公開。
[0029] 此種殺傷，特別是與免疫細胞分泌的抗病毒免疫介導物(例如細胞因子)聯用時， 提供了對HBV感染的根除或者對HBV感染的持續控制或者對表達HBV表面抗原的腫瘤細胞的 消除。本發明優選的或者示例性的雙特異性多肽提供了對HBV感染的細胞或者復制HBV或表 達HBV表面抗原的肝瘤細胞(也稱作肝癌細胞)令人驚訝的高殺傷率;參見本文公開的實施 例。
[0030] 考慮到本發明的雙特異性多肽提供了對免疫效應細胞的訂制的特異性，免疫效應 細胞天然固有的特異性或者將抗原對其呈遞變得無關緊要。由此，大量的候選效應細胞可 以修改以重新靶向。另外，本發明的多肽具有至少與單克隆抗體相當的生物可利用性和半 衰期。
[0031] 在優選的實施方案中（a)所述第一組的6個⑶R被包含在第一個scFv片段中；和/或 (b)(ba)所述第二組的6個CDR被包含在第二個scFv片段中；或者(bb)所述配體是免疫配體， 優選能夠結合 NKG2D/CD314(如配體 MICA、MICB、ULBPl-6)、NKp30/NCR3/CD337(如配體B7-H6)、4-lBB/CD137(如配體4-lBB-L/CD137L)或者0X40/CD134(如配體0X40-L/CD252)。斜線 (7"）分開本領域的不同命名。括號中提供了給定抗原種類的代表。
[0032]術語"scFv"是本領域熟知的。該縮