新型肽標簽以及其用圖
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用于目的蛋白質的檢測或純化的表位(epitope)標記系統，更詳 細的說，涉及一種源自作為耐福射球菌（Deinococcus radiodurans)的感光蛋白質 (photoreceptor protein)的細菌光敏色素（Bacteriophytochrome，BphP)的新型肽標簽， 以及能夠特異地識別上述肽標簽的抗體及能夠產生上述抗體的雜交瘤細胞株。并且，本發 明還涉及編碼上述肽標簽的多核苷酸；涉及包括上述多核苷酸的載體或轉化體；以及包括 上述肽標簽的融合蛋白質及用于制備、檢測或純化上述融合蛋白質的方法和試劑盒。
【背景技術】
[0002] 有用的蛋白質或多肽可通過合成產生或者可以從天然供給源中分離。但是，這種 方法存在在費用、時間方面并不經濟，且生產量有限的缺點。因此，優選通過對重組制備的 轉化體進行培養而生產目的蛋白質和目的多肽，其中上述重組是為使目的蛋白質或目的多 肽過表達而進行的。但是，在細胞環境中產生的多肽(特別是短的多肽）由于存在于細胞的 蛋白酶的作用而易降解(degradation)，而且，并不是所有目的蛋白質都有抗體，因此不易 純化沒有對應抗體的目的蛋白質。
[0003] 為了克服這些問題使用了蛋白質標記或表位標記。蛋白質標記（pr 〇 t e i η tagging)或者表位標記(epitope tagging)是制備將表位標記的編碼序列連接于目的蛋白 質的編碼序列的重組核酸分子后，使其在合適的宿主細胞中表達，再利用對應于表位標記 的抗體對目的蛋白質進行檢測、定量、純化或在目的蛋白質的細胞內追蹤位置，功能鑒定等 的一種重組DNA方法。商業上有很多表位標簽和作為其相應配體的抗體，當選擇合適抗體的 表位標簽和其對應的抗體時，能夠使用蛋白質印跡分析(Western blot analysis)，免疫沉 淀（immunopr e c ipitation)，免疫焚光（immunof luorescence)，免疫細胞化學 (immunocy tochemi stry)，免疫親和純化（immunoaf f inity pur if i cat ion)等方法對目的蛋 白質進行檢測或純化，因此可以消除對目的蛋白質產生抗體的必要性。
[0004]目前使用于蛋白質標記（protein tagging)或者表位標記（epitope tagging)的 表位標簽有從六個氨基酸殘基程度的短肽標簽(例如，6 X組氨酸(Hi st i dine，Hi s)標簽)至 401^&程度大的蛋白質（例如，1^?)的很多獨特的標記[參見5以代1^，1?.(：.，（2000) Structure Fold Des 8:R177-85]，而一般會使用由3至30個氨基酸構成的肽標簽。His-標 記的蛋白質在Ni-NTA(鎳-次氮基三乙酸）的樹脂上被特異性地捕獲，且其可以通過EDTA或 咪唑被洗脫下來。除此之外，麥芽糖結合蛋白質(MBP) (396個氨基酸，40kDa)、金黃色葡萄球 菌蛋白質A、f丐調蛋白質結合肽（CBP) (26個氨基酸，2.96kDa)、綠色焚光蛋白質（Green Fluorescent Protein，GFP)(238個氨基酸，27kDa)及谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)(211 個氨基 酸，26kDa)也可用于原核生物及真核生物蛋白質的檢測或純化。并且，通常最常用的表位標 簽有c-myc標簽，HA標簽，FLAG標簽等。c-myc標簽是源于人的c-myc蛋白質的長度為10個氨 基酸的表位標簽[Evans et al.，（1985)Μ0υθ11·Β?ο1·，12:3610-3616]，HA標簽是源自流 感病毒血凝素 （influenza hemagglutinin)HA-l蛋白質的長度為9個氨基酸的表位標簽
[Field et al.，（1988)Mol .Cell .Biol. ,8:2159-2165]，FLAG 標簽是源自噬菌體 T7 的長度 為8個氨基酸的表位標簽[Hopp et al·，（1988)Bio/Technology ,6:1204-1210]。
[0005] 另外，對于進行表位標記時所使用的表位標簽，應優選使用當其與目的蛋白質融 合時，對目的蛋白質的三維結構和生物活性影響最小的表位標簽。一般長度長的表位標簽 (例如GST標簽或者MBP標簽)會存在改變目的蛋白質的功能等的問題。相反，長度相對較短 的表位標簽，例如，FLAG標簽、c-myc標簽等，幾乎不影響與其融合的目的蛋白質的特性，且 能夠與其對應的抗體高度特異地結合，并且，有些時候不需要從融合蛋白質中去除，因此是 現在主要使用的表位標簽。但是，對于c-myc標簽和FLAG標簽的氨基酸序列，迄今為止已知 的生物體的細胞內的蛋白質中大多數的蛋白質含有相同的序列，從而可能會誘導識別標簽 的抗體的非特異性反應，而這種非特異性抗體反應會妨礙對特定目的蛋白質的分離及確 認，因此存在會降低試驗的可靠性的問題[Ksenija Gasic et al.，（2005)Plant molecular biology reporter23:9-16]。為了克服這種非特異性反應的問題，曾開發過在 蛋白質的N-末端連續融合兩個不同的標簽后使用的親和純化系統[Rigaut，G.，et al. (1999)Nat Biotechnol 17:1030-2]〇
[0006] 因此，需要開發一種新型肽標簽以及可與其配對使用的抗體。上述新型肽標簽以 及可與其配對使用的抗體可以克服現有技術中利用表位標簽及其對應的抗體對在重組宿 主細胞內表達的融合蛋白質進行檢測及純化時存在的問題，即可以克服非特異性反應，同 時具有較短的氨基酸序列。
【發明內容】
[0007] 本發明要解決的技術問題
[0008] 本發明的所要解決的一個技術問題在于，提供一種對檢測或者純化目的蛋白質有 效的新型肽標簽，以及其用途。
[0009] 本發明所要解決的另一個技術問題在于，提供一種能夠特異地識別新型肽標簽或 能夠與新型肽標簽選擇性結合的新型抗體，能夠產生上述抗體的雜交瘤細胞株及其用途。
[0010] 技術方案
[0011] 本發明的發明人在為了開發對目的蛋白質的檢測或者純化有用的肽標簽及相對 應抗體而進行研究的過程中，使用耐福射球菌(Deinococcus radiodurans)的感光蛋白質 細菌光敏色素(Bacteriophytochrcime，BphP)或者其片段作為免疫原，獲得產生單克隆抗體 的雜交瘤，其中上述耐輻射球菌為異養細菌。同時，利用產生的抗體，以耐輻射球菌 (Deinococcus radiodurans)的細菌光敏色素(Bacteriophytochrome，BphP)為對象進行了 表位鑒定(epitope mapping)，發現了由9個氨基酸構成的表位，從而完成了本發明。
[0012] 為解決上述一個目的，本發明提供一種肽標簽，其包含由SEQ ID NO: 1的氨基酸序 列構成的肽或者由SEQ ID N0:2的氨基酸序列構成的肽，作為抗體的識別部位或抗體的結 合部位。另外，本發明提供一種編碼上述肽標簽的多核苷酸。此時，編碼上述肽標簽的多核 苷酸優選包括SEQ ID N0:7的堿基序列或者SEQ ID N0:8的堿基序列。另外，編碼上述肽標 簽的多核苷酸可通過具有SEQ ID N0:16的堿基序列的正向引物和具有SEQ ID N0:17的堿 基序列的反向引物構成的引物對，或者由具有SEQ ID N0:32的喊基序列的正向引物和具有 SEQ ID N0:33的堿基序列的反向引物構成的引物對合成。此外，本發明提供含有編碼上述 肽標簽的多核苷酸的重組載體。此時，上述重組載體可以是克隆載體或者表達載體。另外， 上述表達載體其特征在于，優選可還包括編碼目的蛋白質的目的多核苷酸，上述目的多核 苷酸與編碼肽標簽的多核苷酸連接。此外，本發明提供包含目的蛋白質及與其連接的肽標 簽的融合蛋白質。此時，構成上述融合蛋白質的肽標簽包含由SEQ ID N0:1的氨基酸序列構 成的肽或者由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列構成的肽，作為抗體的識別部位或者抗體的結合 部位。另外，本發明提供一種編碼上述融合蛋白質的多核苷酸。此外，本發明提供一種轉化 體，其特征在于，該轉化體導入有選自編碼上述肽標簽的多核苷酸、包含編碼上述肽標簽的 多核苷酸的重組載體、編碼上述融合蛋白質的多核苷酸、以及包含編碼上述融合蛋白質的 多核苷酸的重組載體中的任意一種。并且，本發明提供一種融合蛋白質的檢測方法，其包 括:使上述融合蛋白質與對應于肽標簽的抗體相接觸并結合的步驟；以及確認結合于上述 抗體的融合蛋白質的存在或對其量進行分析的步驟。此時，上述融合蛋白質可通過導入有 編碼融合蛋白質的多核苷酸或者包括其的重組載體的轉化體進行表達。此外，上述抗體，其 特征在于，其優選為由保藏號為KCTC 12283BP的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體。此外，本 發明提供一種蛋白質的純化方法，其包括:使上述融合蛋白質與對應于肽標簽的抗體接觸 并結合的步驟；以及回收結合于上述抗體的融合蛋白質的步驟。此時，上述融合蛋白質可通 過導入有編碼融合蛋白質的多核苷酸或者包括其的重組載體的轉化體進行表達。此外，上 述抗體，其特征在于，其優選為由保藏號為KCTC 12283BP的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗 體。另外，本發明提供融合蛋白質檢測或者純化用試劑盒，其包括:選自編碼上述肽標簽的 多核苷酸、用于合成編碼上述肽標簽的多核苷酸的引物對、包括編碼上述肽標簽的多核苷 酸的重組載體、編碼上述融合蛋白質的多核苷酸及包括編碼上述融合蛋白質的多核苷酸的 重組載體中的任意一個；以及選自能夠與由SEQ ID NO: 1氨基酸序列構成的肽或者由SEQ ID N0:2氨基酸序列構成的肽特異性結合的抗體，或者產生上述抗體的雜交瘤細胞株中的 任意一個。此外，上述抗體，其特征在于，其優選為由保藏號為KCTC12283BP的雜交瘤細胞株 產生的單克隆抗體。
[0013]為解決上述另一目的，本發明提供對應于由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列構成的肽 或者SEQ ID N0:2的氨基酸序列構成的肽的一種抗體。此時，上述抗體特征在于，其優選為 單克隆抗體。此外，上述單克隆抗體特征在于，其為重鏈同種型（isotype) IgG 2a或者輕鏈 同種型K(kappa)。此外，本發明提供產生上述抗體的雜交瘤細胞株。此時，上述雜交瘤細胞 株特征在于，其保藏號為KCTC 12283BP。另外，本發明提供包括上述抗體或者上述雜交瘤細 胞株的試劑盒。此時，上述抗體特征在于，其固定于支撐體(support)。此外，上述試劑盒優 選可包括上述抗體(對應于由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列構成的肽或者由SEQ ID N0:2的氨 基酸序列構成的肽的抗體)的檢測單元。上述檢測單元優選為二抗，該二抗能夠與對應于由 SEQ ID NO: 1氨基酸序列構成的肽或者由SEQ ID N0:2氨基酸序列構成的肽的抗體結合。此 外，上述二抗優選能夠與選自酶、放射性物質或者熒光物質中的標記物質結合 (conjugate)。此外，上述試劑盒可以用于融合蛋白質的檢測或者純化，其中上述融合蛋白 質包括目的蛋白質及與其連接的由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列構成的肽或者由SEQ ID N0: 2的氨基酸序列構成的肽。
[0014] 有益效果
[0015]根據本發明的新型肽標簽具有短的長度的同時，具有能夠消除現有的c-myc標簽 及FLAG標簽等的非特異性反應的優點。因此，利用根據本發明的新型肽標簽及其對應的抗 體時，能夠非常有效地檢測或者純化重組細胞內表達的融合蛋白質。并且，包括根據本發明 的新型肽標簽及與其對應的抗體的表位標記系統可以適用于特定蛋白質的細胞內定位，功 能鑒定，檢測，純化，以及研究蛋白質間的相互作用等的各種領域中。
【附圖說明】
[0016] 圖1是表示利用His標簽柱層析法對DrBphP及DrBphN進行純化的結果的附圖。圖1 中的A是概略地表示用于表達耐福射球菌(Deinococcus radiodurans)的BphP蛋白質及 BphN蛋白質的基因構建體的模式圖（全長(FL) (1 -755氨基酸，BphP); Δ PHY/HKD (1 -321氨基 酸，BphN))。圖1中的B表示利用Ni+-NTA親和層析法對耐福射球菌（Deinococcus radiodurans)的BphP脫輔基蛋白質(Apoprotein)及BphN脫輔基蛋白質進行純化，并與膽綠 素(BV) -起培養20分鐘后，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，再通過鋅(zinc)-熒光誘 導方法檢測BV結合的結果(右邊）；以及用考馬斯亮藍(Coomassie Blue)染色的結果(左邊） (1: BphP粗提取物，2:純化的BphP，3: BphN粗提取物，4:純化的BphN)。純化條件-結合和洗 滌:pH值8 · 0、1 OOmM的三羥甲基氨基甲烷(Tr i s)，200mM氯化鈉 (NaC 1)，1 OmM咪唑/洗脫:pH值 8 · 0、100mM 的 Tris，200mM氯化鈉，150mM咪唑。
[0017] 圖2是表示利用所選擇的單克隆抗體，對已純化的BphP及BphN進行蛋白質印跡分 析(Western b 1 〇t ana 1 y s i s)的結果的附圖。對已純化的BphP及BphN進行SDS-PAGE后，利用 已純化的BphP的單克隆抗體（288,2(：11，382,302,3!17)進行蛋白質印跡分析（？ ：8?1^，1 BphN)。通過蛋白質印跡分析確認了單克隆抗體中2B8抗體識別存在于蛋白質的N-末端的表 位。
[0018]圖3表示確認Oat PhyA是否與BphP的五種單克隆抗體發生反應的結果。其中，該 Oat PhyA是構成N-末端部位的PCD結構與DrBphP相類似的燕麥光敏色素蛋白質（Oat phytochrome protein)。
[0019] 圖4表示通過蛋白質印跡分析的2B8抗體的一次表位鑒定的結果。在圖4中"a-GST" 表示抗-GST抗體。
[0020] 圖5表示通過蛋白質印跡分析及考馬斯亮藍染色的2B8抗體的二次表位鑒定的結 果。
[0021] 圖6是表示能夠將BRT標簽連接于GST蛋白質N-末端的融合蛋白質在大腸桿菌中正 常表達，且能夠通過2B8抗體對融合蛋白質進行檢測的蛋白質印跡分析結果。在圖6中"a-myc"表示抗-myc抗體，"a-GST"表示抗-GST抗體。
[0022] 圖7是表示能夠將BRT標簽連接于GFP的N-末端的融合蛋白質在植物細胞中正常表 達，且能夠通過2B8抗體對融合蛋白質進行檢測的蛋白質印跡分析結果。在圖7中"myc"表示 抗-my c抗體。
[0023 ]圖8表示使用2B8抗體對多種細胞蛋白質進行蛋白質印跡分析的結果，以及對用于 蛋白質印跡分析的細胞蛋白質樣品進行考馬斯亮藍染色的結果。
[0024]圖9表示通過對轉化細胞進行培養，使在DrBphN蛋白質（SEQ ID N0:6)中去除第1 ~11位的氨基酸的DrBphN變形蛋白質的C-末端分別結合BRT標簽、Flag標簽、His標簽及Myc 標簽的融合蛋白質表達，并在提取總蛋白質后通過蛋白質印跡分析觀察表達狀態的結果， 以及對用于蛋白質印跡分析的各種融合蛋白質樣品進行考馬斯亮藍染色的結果。
【具體實施方式】
[0025]本發明一方面涉及一種新型肽標簽，其可用于對目的蛋白質進行純化或檢測的表 位標記系統。根據本發明的新型肽標簽包括由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列構成的肽或者由 SEQ ID N0:2的氨基酸序列構成的肽，以作為抗體的識別部位或者抗體的結合部位。本發明 的說明書中的肽標簽與蛋白質標簽或者表位標簽可以相互交換使用。本發明中的術語"肽 標簽"是指融合到目的蛋白質可以用作標簽的肽。并且，本發明中的術語"表位"是指能夠被 特定抗體識別的抗原結合部位或者與B細胞或T細胞進行反應的抗原的一定部位。作為抗體 的識別部位或者抗體的結合部位，根據本發明的肽標簽包括由SEQ ID N0:1的氨基酸序列 構成的肽或者由SEQ ID N0:2的氨基酸序列構成的肽時，其長度基本沒有限制。例如:根據 本發明的肽標簽考慮到通常用于表位標簽的氨基酸殘基數時，優選為具有9至30個氨基酸 殘基的肽，更優選為由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列構成的肽或者由SEQ ID N0:2的氨基酸序 列構成的肽。由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列構成的肽或者由SEQ ID N0:2的氨基酸序列構成 的肽源自作為耐福射球菌（Deinococcus radiodurans)的感光蛋白質的細菌光敏色素 (Bacteriophytochrome，BphP)。詳細而言，由上述SEQ ID NO: 1的氨基酸序列構成的肽是由 在作為耐福射球菌（Deinococcus radiodurans)的感光蛋白質的細菌光敏色素 (Bacteriophytochrome，BphP)的所有氨基酸序列（SEQ ID N0:3)中，與以N-末端為基準的 第3位至第11位相對應的氨基酸殘基所構成的肽。并且，由上述SEQ ID N0:2的氨基酸序列 構成的肽是由在作為耐福射球菌(Deinococcus radiodurans)的感光蛋白質的細菌光敏色 素(Bacteriophytochrome，BphP)的所有氨基酸序列（SEQ ID N0:3)中，與以N