單管中多重靶核酸的實時熒光pcr檢測方法及其試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于核酸檢測技術領域，涉及在單個PCR反應容器中多重檢測樣品中靶核 酸的PCR方法，具體涉及一種單管中多重靶核酸的實時熒光檢測PCR方法以及檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 自1971年開始HBsAg作為常規篩查項目引入到血液篩查，使得輸血后感染乙肝的 發生率大大降低，但每年仍有少量新發輸血后肝炎病例報道。例如美國無償獻血者每單位 供血傳播HBV的危險性為1/6.3萬。這些危險主要來自HBV"窗口期"、病毒變異、低病毒載量 感染等。間接酶聯免疫法(ELISA)篩查并不能從根本上排除病毒存在的危險，由于HBV感染 后病毒顆粒先于HBsAg釋放到血液中，在約50天的"窗□期"內，感染者的HBsAg檢測呈陰性， 但是其血液卻具傳染性。而使用核酸檢測(Nucleic acid test，NAT)技術能提前20天篩查 出HBsAg陰性、HBV-DNA陽性獻血者。
[0003] 隨著血液制品在世界范圍的流通，HCV感染呈世界性分布，為了控制丙型肝炎病毒 的血液傳播，世界各國均開展了對獻血員抗-HCV的檢測。常用的抗-HCV診斷試劑采用間接 酶聯免疫法(ELISA)，第一代抗-HCV ELISA采用的抗原C100-3是HCV非結構基因（NS3/NS4) 和人超氧化物歧化酶基因嵌合后表達的融合蛋白，靈敏度低，漏檢率較高；第二代抗-HCV ELI SA在第一代基礎上增加了核心區重組蛋白C22和NS3區重組蛋白C33c，雖然在靈敏度和 特異性上有很大改善，但仍不能排除由于重組融合蛋白帶來的少數假陽性和極少數的漏 檢。目前我國多采用第三代抗-HCV ELISA試劑，其包被抗原為HCV核心抗原、NS3、NS4和NS5 抗原，特異性超過99%，雖然目前缺乏判斷其敏感性的金標準，但對于免疫功能正常的HCV-RNA陽性感染者，抗-HCV檢出率也高于99% ACV感染后一般到抗體轉陽有一個較長的窗口 期，平均為70天，有的患者窗口期可延長至6-9月或更長，約1%-3%的患者抗-HCV可持續陰 性，而基因組的復制出現得很早，感染后數天即出現病毒血癥。已有輸血后即有丙型肝炎病 毒感染發生的報道，這表明抗-HCV陰性的獻血員中有少數存在丙型肝炎病毒輸血傳播的可 能性。
[0004] 人類獲得性免疫缺陷綜合癥簡稱艾滋病，是由一種存在于血液中并攻擊免疫系統 的病毒引起的。據WHO估計，我國艾滋病感染人數到2010年將達到1000萬，并持續高速增長。 血液傳播是艾滋病毒傳播的重要途徑之一。全球每年增加560萬艾滋病毒攜帶者，有5%至 10%的人是經過輸血或血液制品而感染的。
[0005] 根據所采用的檢測方法的靈敏度不同，感染窗口期的長短不同。采用核酸測定方 法，HIV的感染窗口期為11天;采用第3代EIA試劑盒，HIV的感染窗口期為22天;采用第4代 EIA試劑盒，HIV的感染窗口期為18天。由于空白窗口期的存在，即使未來技術的靈敏度足以 消除感染窗口期，仍然無法將HIV感染的窗口期縮短為零。
[0006] 目前，在臨床上篩選各種血源性傳播疾病的方法，主要是免疫學診斷方法。盡管隨 著第三代單克隆診斷抗體的出現，在很大程度上增加了篩查和檢測的靈敏度，并在一定程 度上減少了血源傳播病毒性疾病的概率。但由于受免疫學診斷方法的靈敏度及其與生倶來 的限制，依然不能完全杜絕陽性病毒血樣的漏檢，漏檢率較高。其主要原因在于，免疫學診 斷主要依賴抗原抗體介導的免疫反應，而病毒感染機體后，機體產生可檢測水平的高滴度 抗體的需要一段相對較長的時間。另外，由于個體免疫機能不同，其中有少數感染者感染后 機體所產生的抗體滴度有可能低于免疫學檢測線一下，甚至不產生抗體。因此，免疫學診斷 方法不能檢測出處于窗口期和新近感染病毒的獻血員，這樣勢必導致漏檢。其次，抗原出現 變異以及稀有亞型也可導致漏檢，因此，免疫學篩查后，輸血相關疾病傳播依然存在一定的 概率。
[0007] 目前免疫學檢測以上三種病毒的平均窗口期分別為:HBV56天，HCV70天，HIV22天。 近5年來，隨著以核酸檢測(Nucleic acid test，NAT)為代表的分子生物學技術在血液篩查 方面的應用，輸血及血制品安全性有了很大的提高。在理論上，NAT技術能夠顯著的縮短病 原體檢出的窗口期。另外，NAT技術靈敏度和特異性均較顯著的高于免疫學方法。核酸檢測 HBV，HCV，HIV病毒的窗口期較抗體檢測分別提前:9天、25天、14天。而應用NAT技術篩查獻血 員，相應的可將獻血員傳播以上病毒性疾病的概率分別降低42%、72%和50%。
[0008] 但是現有的核酸檢測技術具有以下缺點：（1)以諾華診斷的TMA方法以及羅氏診斷 等采用單管檢測，但是不能區分HBV，HCV及HIV-1病毒種類，根據中國國情，如血液中心檢測 到HIV-1反應性樣本，需報當地疾病預防控制中心做確診檢測，因此血液中心還需要采購這 些廠家的病毒種類檢測試劑，增加了成本；
[0009] (2)以達安基因，科華生物為代表的采用三管檢測技術，會限制檢測通量。例如，同 樣采用96孔的PCR儀器，科華需要三個孔才能檢測一個樣本，整機不計算對照樣品最多檢測 32個樣本，試劑整體的成本也較高;另外核酸提取模板要分成三份分別檢測，試劑靈敏度受 影響較大，尤其是針對隱匿性乙肝造成潛在漏檢風險。
【發明內容】
[0010] 為了解決以上技術問題，本發明實施例中提供了一種單管中多重靶核酸的實時熒 光檢測PCR方法，每種病毒靶核酸分別是HBV-DNA，HCV-RNA和HIV-1-RNA，其包括如下步驟：
[0011] (1)在單個PCR反應管中混合樣本核酸，Tth DNA聚合酶，H-Taq DNA聚合酶，Μη (OAc) 2，dNTPs，內標，HBV-DNA、HCV-RNA以及HIV-1-RNA的上下游引物和探針，以及內標探 針，針對所述的各種探針標記有熒光基團和熒光淬滅基團，而且各種探針標記的熒光基團 的檢測波長不同；其中，
[0012] 所述HBV-DNA上游引物的堿基序列為：SEQ ID NO: 1
[0013] 5 '-TTCAAGCCTCCAAGCTGTGC-3 '；
[0014] 所述HBV-DNA下游引物的堿基序列為：SEQ ID N0:2
[0015] 5 '-AGAGTAACTCCACAGWAGCTCCAA-3 '；
[0016] 所述HBV-DNA探針的堿基序列為：SEQ ID NO:3
[0017] 5，-TTGGGTGGCTTTGGGGCATGGA-3，；
[0018] 所述HCV-RNA上游引物的堿基序列為:SEQ ID N0:4
[0019] 5 '-AGTGTCGTRCAGCCTCCAGG-3 '；
[0020] 所述HCV-RNA下游引物的堿基序列為:SEQ ID N0:5
[0021 ] 5 '-GGTGTACTCACCGGTTCCG-3 '；
[0022] 所述HCV-RNA探針的堿基序列為:SEQ ID N0:6
[0023] 5，-CCCCCTCCCGGGAGAGCCAT-3，；
[0024] 所述HIV-1-RNA上游引物的堿基序列為:SEQ ID N0:7
[0025] 5 '-CCTCAGATGCTGCATAWAAGCAG-3 '；
[0026] 所述HIV-1-RNA下游引物的堿基序列為:SEQ ID N0:8
[0027] 5 '-CCAGAGAGCTCCCAGGCTC-3 '；
[0028] 所述HIV-1-RNA探針的堿基序列為：SEQ ID NO:9
[0029] 5 '-TGTACTGGGTCTCTCTDGTTAGACCAGAT-3 '；
[0030] 所述內標探針的堿基序列為:SEQ ID NO: 10
[0031] 5 '-AACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACG-3 '；
[0032] 所述內標的擴增子序列的堿基序列為:SEQ ID NO: 11
[0033] 5 '-CCTCAGATGCTGCATATAAGCAGTTCCAAGTTGTAAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGTTCC AAGTTGTAGAGCCTGGGAGCTCTCTGG-3,；
[0034] (2)進行PCR反應，并實時檢測不同波長的熒光；
[0035] (3)選擇?六1通道檢測!11￥-11?祖，1?(?通道檢測!1(^-1?熟陽性樣本，0￥5通道檢測冊￥-DNA;根據熒光檢測結果計算出的Ct值判斷是否有HBV-DNA，HCV-RNA和HI V-1-RNA中的一種 或幾種病毒靶核酸存在于樣品。
[0036]優選的，上述的方法，其中，所述內標是競爭性內標，其與HIV共用所述HIV-1-RNA 的上下游引物。
[0037] 優選的，上述的方法，其中，所述內標包含在人造病毒顆粒內。
[0038] 優選的，上述的方法，其中，所述各種探針標記有不同的熒光基團。
[0039] 優選的，上述的方法，其中，所述PCR反應條件為：（1)預變性和酶激活，95°C，1分 鐘，循環數為1;(2)逆轉錄，60°C，30分鐘，循環數為l;(3)cDNA預變性，95°C，1分鐘，循環數 為1; (4)變性，退火，延伸及熒光采集，循環數為45,其中變性95°C，15秒;退火，延伸及熒光 采集，60 °C，30秒；（5)儀器冷卻，25 °C，10秒，循環數為1。
[0040] 優選