鑒定香港巨牡蠣、有明牡蠣、太平洋牡蠣及其雜交種的微衛星引物和鑒定方法
【技術領域】：
[0001] 本發明屬于水產生物技術中的貝類分子標記和物種鑒定領域，具體涉及鑒定香港 巨牡蠣、有明牡蠣、太平洋牡蠣及其雜交種的微衛星引物和鑒定方法。
【背景技術】：
[0002] 微衛星DNA，又稱作短串連重復（STRs)、簡單重復序列（SSRs)、簡單序列長度多態 性(SSLP)，是指基因組中以1~6個核苷酸為單位串聯組成的核苷酸序列。近年來，微衛星標 記以其簡單高效等優點被廣泛應用于物種鑒定和雜交種分析。
[0003] 牡蠣屬于軟體動物門、雙殼綱、珍珠貝目、牡蠣科，為全球性分布類群;牡蠣肉味鮮 美、富含多種人體必需氨基酸，是一種重要的海洋生物資源，更是世界上最重要的海水養殖 經濟類群之一，其養殖總產量和單位面積產量在所有的貝類養殖種類中位居首位。牡蠣也 是中國產量最大的經濟貝類，其中具有較高經濟價值的香港巨牡蠣、有明牡蠣、太平洋牡蠣 在中國已進行人工養殖。香港巨牡(Crassostrea hongkongensis)喜歡生活在近河口或 附近有淡水注入的地方，主要分布在浙江、福建、廣東、廣西、海南，年產量在100多萬噸。其 肉柱肥大、肉質白嫩、味道鮮美，市場價格遠超過其它牡蠣品種。是暖溫性近岸生長的一個 經濟價值極高的牡類群，是我國南方養殖的主要經濟種。有明牡_(Crassostrea ariakensis)在我國南北沿海均有分布，主要集中在廣東、廣西，分布于我國南北低鹽海。其 肉味鮮美、營養豐富，是我國南方諸省的重要海水養殖經濟貝類，已有近兩百年的養殖歷 史。太平洋牡(Crassostrea gigas)分布在我國長江以北，為世界性養殖品種，主要集中 在我國遼寧、山東等地，年產量近80萬噸。由于生長速度快、環境適應性強、肉味鮮美，深受 廣大消費者青睞。牡蠣的外部形態常隨生活環境的不同而發生極大的變化，單純依靠形態 特征往往難以鑒別。而牡蠣軟體部的解剖結構、染色體數目和核型差異很小，可提供的分類 證據也很少。近年來，基于C0I、16S rDNA等線粒體基因和ITS序列差異的分子生物學被用于 三者鑒定，但這些基因序列之間差異比較小，難以用電泳等簡單方法進行區分;HRM方法雖 然簡單，但需要相關大型儀器支撐;而測序試驗周期較長，且花費較高。急需一種簡單高效 的方法對香港巨牡蠣、有明牡蠣、太平洋牡蠣個體進行大規模物種鑒定。
[0004] 另外隨著牡蠣養殖業對優良新品種需求的不斷增加，種間雜交研究在牡蠣間不斷 進行，學者們陸續開展了香港巨牡蠣X太平洋牡蠣、香港巨牡蠣X有明牡蠣、太平洋牡蠣X 有明牡蠣雜交組合的研究，并證明部分種間雜交牡蠣的精卵能夠結合，并正常發育。對獲得 的雜交后代進行遺傳鑒定是很必要的，因為在牡蠣的種間雜交種經常會出現雌核發育、雄 核發育、單倍體等現象。急需一種簡單方法對香港巨牡蠣、有明牡蠣、太平洋牡蠣的雜交個 體進行分子鑒定。
【發明內容】
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[0005] 本發明的目的是提供一種簡單、高效和精確的鑒定香港巨牡蠣、有明牡蠣、太平洋 牡蠣及其雜交種的微衛星引物和鑒定方法。
[0006] 本發明從150對香港巨牡蠣微衛星引物中篩選出的1對微衛星（SSR)引物，用其對 香港巨牡蠣、有明牡蠣、太平洋牡蠣各90個個體的基因組DNA進行PCR擴增，通過擴增圖譜可 以簡單高效的進行物種鑒定，另外對三者間的雜交種個體鑒定也有潛在應用價值，從而實 現了本發明的目的。
[0007] 本發明的鑒定香港巨牡蠣、有明牡蠣、太平洋牡蠣及其雜交種的微衛星引物，其特 征在于，所述的微衛星引物(SSR引物Ch409)為：
[0008] F:5'-CGACTGGTGGGAGITTCTGAC-3'（如SEQ ID N0.1 所示）；
[0009] R:5'-GCCGCTTCTATCTCCTTTGC-3'（如SEQ ID 恥.2所示）。
[0010] 本發明的香港巨牡蠣、有明牡蠣、太平洋牡蠣及其雜交種的鑒定方法，其特征在 于，包括以下步驟：
[0011] 提取牡蠣樣品的基因組DNA，以該基因組DNA作為模板，用上述微衛星引物進行PCR 擴增，PCR產物進行凝膠電泳，然后分型判定；
[0012]由于SSR引物Ch409產生的香港巨牡蠣特異條帶范圍在308bp~347bp之間，有明牡 特異性條帶范圍在362bp~422bp之間，太平洋牡特異性條帶范圍在206bp~242bp之 間，三者之間沒有等位基因重疊區，可以明顯區分三種牡蠣的個體。如果PCR產物，若在 308bp~347bp區間內出現1~2條條帶，則該牡蠣樣品為香港巨牡蠣，出現1條條帶說明該個 體為純合子，出現2條條帶則說明該個體為雜合子;若在362bp~422bp區間內出現1~2條條 帶，則該牡蠣樣品為有明牡蠣，出現1條條帶說明該個體為純合子，出現2條條帶則說明該個 體為雜合子;若在206bp~242bp區間內出現1~2條條帶，則該牡蠣樣品為太平洋牡蠣，出現 1條條帶說明該個體為純合子，出現2條條帶則說明該個體為雜合子;如果PCR產物同時在 308bp~347bp區間和362bp~422bp區間內各出現1條帶，即同時擁有親本的1條特異性條帶 的個體為香港巨牡蠣與有明牡蠣雜交子一代，缺少其中的任意一個條帶均為假雜種;如果 PCR產物同時在308bp~347bp區間和206bp~242bp區間內各出現1條帶，即同時擁有親本的 1條特異性條帶的個體才為香港巨牡蠣與太平洋牡蠣雜交子一代，缺少其中的任意一個條 帶均為假雜種；如果PCR產物同時在362bp~422bp區間和206bp~242bp區間內各出現1條 帶，即同時擁有親本的1條特異性條帶的個體為有明牡蠣與太平洋牡蠣雜交子一代，缺少其 中的任意一個條帶均為假雜種。
[0013]所述的以該基因組DNA作為模板，用上述微衛星引物進行PCR擴增優選PCR反應體 系為：DNA模板50ng，Buf f er 10mM，微衛星引物F和微衛星引物R各0.2mM，dNTP 0.2mM，Mg2+ 2 · OMm，Taq DNA聚合酶1U，用滅菌水補足25yL;反應程序為:94。。預變性5min; 94。。變性30s， 60°C 退火 30s，72°C 延伸 lmin，30 個循環；72°C 延伸 lOmin。
[0014] 本發明從150對香港巨牡蠣微衛星引物中篩選出一對能夠在香港巨牡蠣、有明牡 蠣、太平洋牡蠣中通用并且可以根據擴增條帶大小區分三種牡蠣，同時帶型清晰、重復性 好、可靠性強的微衛星引物:Ch409,并在三者間的雜交種個體鑒定也有潛在應用價值。
[0015] 由于牡蠣的外部形態常隨生活環境的不同而發生極大的變化，單純依靠形態特征 往往難以鑒別;幼體階段的牡蠣根據形態特征更加難以區分。而利用本發明的微衛星引物， 采用本發明的鑒定方法，可以快速、準確地鑒定出香港巨牡蠣、有明牡蠣、太平洋牡蠣個體， 并且在三者間的雜交種個體鑒定中也具有潛在的應用價值，同時本發明具有方法簡單、結 果直觀、準確有效、不受環境及發育時期影響、成本低廉等優點。
【附圖說明】：
[0016] 圖1為微衛星引物Ch409在太平洋牡蠣、有明牡蠣、香港巨牡蠣部分個體間的電泳 染色對比圖譜；1~9是太平洋牡蠣個體，其中2、3、4、5、6、7、8為雜合子，其他為純合子，10~ 19是有明牡蠣個體，其中11、12、14、16、17、19為雜合子，其他為純合子，20~29是香港巨牡 蠣個體，其中20、21、25、26、27、29為雜合子，其他為純合子。
【具體實施方式】：
[0017] 以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0018] 實施例1:
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