一種牙鲆幼魚性腺mRNA原位雜交的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及幼魚性腺mRNA原位雜交技術，具體的說是一種牙鲆幼魚性腺mRNA原位 雜交的方法。
【背景技術】
[0002] 牙鲆，俗稱牙片，為鲆鰈魚類，錄屬于鰈形目、牙鲆科、牙鲆屬，是我國和日韓等國 的重要海水養殖魚類。牙鲆具有雄魚比雌魚生長快、個體大的特點，牙鲆已逐步在性別決定 與分化研究領域成為海水經濟魚類模式物種，研究其性別決定與分化的機制，確定性別決 定與分化相關的基因，并以此為基礎，對其實施性別控制，具有重要的理論和實踐意義。通 過牙鲆幼魚性腺mRNA原位雜交可以解析性別決定和分化相關基因的表達模式及相互關系， 但是牙鲆幼魚早期性腺較小、分離困難，而性腺組織較大時期難以直接進行性腺原位雜交， 使得該技術難以應用。因此建立牙鲆幼魚性腺mRNA原位雜交的方法，對于牙鲆性別決定和 分化相關規律的闡述具有重要的意義；另外本發明在其它魚類幼魚性腺等組織的原位雜交 進行基因定位和功能研究方面將有一定應用前景，甚至可以開發相關檢測試劑盒而進行產 業化生產。
【發明內容】
[0003] 本發明在于提供一種牙鲆幼魚性腺mRNA原位雜交的方法。
[0004] 為實現上述目的本發明采用的技術方案為：
[0005] -種牙鲆幼魚性腺mRNA原位雜交的方法：
[0006] 1)取洗滌后樣品經過量濃度為4%PFA溶液固定；固定后用100 %甲醇溶液于-20°C 保存，將上述固定后保存樣品經處理作為原位雜交樣品；
[0007] 2)上述原位雜交樣品進行復水、洗滌、蛋白酶K消化、固定而后經洗滌、預雜交，預 雜交后與含有牙鲆RNA探針的雜交液混合于50-70°C下雜交過夜；雜交處理后洗滌，并經抗 體孵育，再洗滌，避光顯色，終止顯色，再固定，再洗滌，20-30 %蔗糖沉降；
[0008] 3)上述沉降樣品經0CT包埋后進行冰凍切片，進而實現對牙鲆幼魚性腺mRNA原位 雜交的標記。
[0009] 所述樣品為根據幼魚全長不同分別取樣，幼魚全長〈60.0_的取其整個腹部;幼魚 全長>60.0mm直接剝離性腺，取樣后無 RNA酶的PBS緩沖液漂洗，待用。
[0010]所述經固定后保存的腹部樣品去除多余內臟;經固定后保存的性腺樣品的系膜剝 離去除、將性腺切成約5mm。
[0011] 具體待做原位雜交前，將上述固定后保存樣品進行進一步處理(腹部樣品盡量去 除多余內臟，性腺樣品的系膜剝離去除、將性腺切成5_左右大小），以獲得原位雜交樣品；
[0012] 將原位雜交樣品依次經體積比3 : 2和2 : 3的，濃度為100 %甲醇和無 RNA酶的1 X PBST緩沖液分別進行復水處理10-30min，復水處理后用過量的無 RNA酶的1 X TOST緩沖液洗 滌，洗滌后加入蛋白酶K(10μg/ml)于37°C處理消化10_30min，消化后經過量的4%PFA溶液 再固定20-60min，再固定后經過量無 RNA酶的1 X TOST緩沖液洗滌，洗滌后樣品在過量預雜 交液中于50-70°C預雜交2-5h。
[0013] 所述無 RNA酶的1 XPBST緩沖液成分為：136.89mM NaCl，2.67mM KCl，8.24mM Na2HP04，1 · 76mM KH2P04，0 · 1 (v) % Tween-20，由無 RNA酶水配置，PH7 · 4。
[0014] 所述預雜交液為50(v)%去離子甲酰胺，25(v)%20XSSC(生工，中國），50μg/ml肝 素，500μg/ml酵母tRNA，0.1 (v) %Tween-20，1M的梓檬酸460μ1，加無 RNA酶的水定容至50ml。 [0015] 所述含有牙鲆RNA探針的雜交液是將用預雜交液稀釋RNA探針至終濃度為l-2ngAi 1，再將其置于80 °C變性30min，變性后，待用。
[0016] 所述探針為RNA探針，是以在性腺內表達基因的cDNA為模板構建探針載體，在體外 轉錄合成的帶有地高辛標記的、并與該基因的核苷酸序列互補結合的一段單鏈cRNA分子。 其中，nr5a2、nr0bl、〇7口193、(11]11'1:1、;1；'(?12等性腺發育相關基因均可用來構建并合成1?嫩探 針。
[0017] 樣品為根據幼魚全長不同分別取樣，幼魚全長〈60.0mm的取其整個腹部;幼魚全長 >60.0mm直接剝離性腺，取樣后無 RNA酶的PBS緩沖液漂洗，待用。
[0018] 所述預雜交后與含有牙鲆RNA探針的雜交液混合于50-70 °C下雜交過夜，然后依次 于50-70°C下用過量的體積比為1:1的不含肝素和酵母tRNA的預雜交液和2XSSC的混合液 洗滌30-60min，洗滌后用過量2 X SSC洗滌30-60min，再用含0.1CHAPS的0.2 X SSC洗滌兩次， 每次30-60min;最后在室溫下用MAB溶液洗滌5-10min。
[0019] 所述雜交處理洗滌后樣品用封閉液于室溫下水平搖床封閉2_4h，而后加入堿性磷 酸酶抗體在4 °C孵育過夜，再洗滌，避光顯色，終止顯色，再固定，再洗滌，20-30 %蔗糖沉降。
[0020] 所述封閉液為含10%羊血清、2%封閉劑的1 XMAB。
[0021] 本發明具有如下優點：
[0022] 本發明在牙鲆幼魚中運用性腺mRNA原位雜交的技術結合雜交后冰凍切片的方法 來獲得相關基因在不同性腺發育時期的表達模式，解決了牙鲆幼魚早期性腺較小、分離困 難，而性腺組織較大時期難以直接進行性腺原位雜交的難題，將有助于進一步闡述牙鲆性 別決定和分化的相關規律;另外本發明在其它魚類幼魚性腺等組織的原位雜交進行基因定 位和功能研究方面將有一定應用前景，甚至可以開發相關檢測試劑盒而進行產業化生產。
【附圖說明】
[0023]圖1為本發明實施例提供的牙鲆nr5a2基因在幼魚(全長〈60.0mm)性腺中的mRNA原 位表達的示意圖。其中，nr5a2在全長4cm牙鲆幼魚(人工雌核發育誘導牙鲆，用雌二醇誘導） 性腺中的表達模式，箭頭所指位置是性腺。
[0024] 圖2為本發明實施例提供的牙鮮cypl9a基因在幼魚(全長>60.0mm)卵巢中的原位 表達的示意圖。其中，牙鲆cypl9a基因在卵巢中的表達模式，星號所指位置是卵原細胞，短 箭頭所指位置是濾泡細胞，長箭頭所指位置是卵母細胞。
[0025] 圖3為本發明實施例提供的牙鲆dmrtl基因在幼魚(全長>60.0mm)精巢中的原位表 達的示意圖。其中，牙鲆dmrtl基因在精巢中的表達模式，長箭頭所指位置是精母細胞，短箭 頭所指位置是支持細胞。
【具體實施方式】
[0026] 下面結合實施例詳述本發明的實驗步驟。
[0027] 本發明解決了牙鲆幼魚性腺原位雜交困難的問題，包括幼魚早期性腺過小難于解 剖獲取和性腺組織較大時期難于直接進行性腺原位雜交的問題，本發明的實施能夠清晰地 描述牙鲆相關基因在性腺中的定位(mRNA水平），取得了突破性的進展；另外本發明在其它 魚類幼魚性腺等組織的原位雜交進行基因定位和功能研究方面將有一定應用前景，甚至可 以開發相關檢測試劑盒而進行產業化生產。
[0028] 實施例1
[0029] 丨.取樣，洗樣。
[0030] 樣品為一條全長小于60.0mm的幼魚取其整個腹部樣品；將樣品用無 RNA酶的IX PBS緩沖液（1XPBS緩沖液成分為136.89mM NaCl，2.67mM KCl，8.24mM Na2HP〇4;1.76mM KH2PO4，由無 RNA酶水配置，PH7 · 4)漂洗；
[0031] 2.固定。洗滌以后的上述樣品置于無 RNA酶離心管中，樣品與濃度為4%的PFA按體 積為1:10混合，而后顛倒混勻以后，平放于4 °C，固定10h。所述PFA由4g PFA溶解于100ml無 RNA酶的1 X PBS緩沖液得到。
[0032] 3.長期保存。將上述固定處理的樣品用100%甲醇溶液漂洗兩次，而后置換于4% PFA溶液中，置于-20°C長期保存。
[0033] 4.解剖。將上述固定后保存樣品盡量去除多余內臟進行進一步處理，以獲得原位 雜交樣品。
[0034] 5.復水。將上述獲得原位雜交樣品依次經體積比3:2和2:3的，濃度為100 %甲醇和 無 RNA酶的1 X PBST緩沖液分別進行復水處理30min;洗滌后再用100 % 1 X PBST洗滌四次，每 次30min。
[0035] 6.蛋白酶K消化。經上述復水后得樣品用蛋白酶K (1 Oμg/ml)于37 °C處理15min。 [0036] 7 .再固定。經上述消化后樣品用4%PFA溶液漂洗一次，再用4%PFA溶液于室溫水 平搖床上再固定60min。
[0037] 8 .洗滌。固定處理后在用100 %無 RNA酶PBST漂洗一次，而后再用100 %無 RNA酶 PBST洗滌五次，每次lOmin。
[0038] 9.預雜交。上述洗滌后樣品及400μ1預雜交液加入至1.5ml無 RNA酶離心管，于65 °C 雜交爐進行預雜交，預雜交4h。
[0039] 所述預雜交液（以50ml為例）：50(￥)%去離子甲酰胺，25(￥)%20\33(：(生工，中 國），50μg/ml肝素，500μg/ml酵母tRNA，0 · l(v) %Tween_20,1M的梓檬酸460μ1，加無 RNA酶水 至50ml。
[0040] 10.雜交：用預雜交液將探針稀釋至終濃度2ngAU，80°C變性30min;每1.5ml離心 管中加入洗滌后所有樣品，再加入200μ1變性好的探針，于65°C雜交過夜。
[00411構建nr5a2探針載體的引物序列如下：
[0042] F:5 '-AAGATCCTGGCGTACCTG-3 '
[0043] R:5 '-ACTCGCTCTTTGTCCTTCA-3 '
[0044] 11.雜交后洗滌。
[0045] 1)雜交處理后于65°C下用過量的50(v)%50(v)%預雜交液（不含肝素和酵母 tRNA): 50( v) % 2 X SSC混合液洗滌一次，60min;
[0046] 2)65°(：下用過量的2\33(：洗滌一次，6〇1^11;
[0047] 3)65°(：下用過量的含0.10^?3的0.2\33(：洗滌兩次，每次6〇1^11;
[0048] 4)室溫下用1 X MAB溶液（1 X MAB溶液為100mM馬來酸，150mM NaCl，pH7.5)洗滌一 次，10min〇
[0049] 12.封閉。洗滌后每管加入500μ1封閉液(封閉液為1 XMAB中加入10 %羊血清，2 % 封閉劑(Roche，美國），室溫下封閉4h。
[0050] 13.抗體孵育。封閉后加入一抗(按照1:2000用封閉液進行稀釋），4°C孵育過夜。
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