牛羊豬犬布魯氏菌分型熒光pcr檢測試劑盒及其制備與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術檢測領域，具體涉及一種牛羊豬犬布魯氏菌分型熒光PCR檢 測試劑盒及其制備與應用。
【背景技術】
[0002] 布魯氏菌是革蘭氏陰性，無芽孢兼性細胞內寄生的細菌，是引起人畜共患傳染病 布病的病原體。家畜感染后能引起母畜流產，公畜睪丸炎，導致患病家畜繁殖能力和生產性 能下降，并影響畜產品的質量和安全，可造成嚴重經濟損失;人感染后能引起波浪熱、關節 炎以及睪丸炎、附睪炎，孕婦可引起流產等，嚴重者可喪失勞動能力。嚴重影響我國畜牧業 發展和人類健康。
[0003] 布魯氏菌的主要宿主為牛羊豬犬等家畜和野生動物，也存在于海洋動物中。通過 刀傷、擦傷、口腔粘膜、鼻腔、眼結膜、生殖道，甚至未損傷的皮膚等途徑而感染。人的感染幾 乎都是由于接觸感染動物所致，人和人之間的傳播罕見(母乳感染嬰兒除外）。
[0004] 布魯氏菌屬目前分為10個種，包括牛種(B.abortus)、羊種(B.melitensis)、豬種 (B. suis)、犬種(B. canis)、綿羊附睪種(B.ovis)、沙漠森林野鼠種(B.neotomae)、田鼠種 (B.microti)、B.ceti(分離自鯨魚和海豚）、13.口;[11111口6(113118(分離自鰭足類）、和 B. inopinata(分離自病人）。
[0005] 每年由于牛羊流產給養殖業造成了巨大的經濟損失，豬和犬感染也比較常見，這 些動物與人類關系密切，容易導致人換布魯氏病。
[0006] 目前用于布魯氏菌分型的方法很多，有限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)、Rep-PCR和ERIC-PCR、rpoB基因多態性、多位點測序分型(MLST)及測序法等。但沒有統一的標準， 很多方法都存在實驗過程比較繁瑣、耗時，且多數方法都有一部分非典型株用現有方法無 法分型。嚴重影響了布病的流行病學調查和疫病預防。
[0007] 基于熒光定量PCR法聯合檢測布魯氏菌羊種、豬種、犬種和牛種布魯氏菌試劑盒能 夠快速診斷出哪種布魯氏菌感染，更簡便快捷準確地對布魯氏菌屬進行分型。有利于分子 流行病學調查、病原菌的溯源及分析菌株間的差異關系。
【發明內容】
[0008] 針對現有技術中所存在的問題，本發明的目的在于提供一種牛羊豬犬布魯氏菌分 型熒光PCR檢測試劑盒及其制備與應用。
[0009] 為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0010] 本發明的第一方面，提供一種牛羊豬犬布魯氏菌分型熒光PCR檢測試劑盒，所述試 劑盒中包括牛布魯氏菌檢測引物及探針、羊布魯氏菌檢測引物及探針、豬布魯氏菌檢測引 物及探針、犬布魯氏菌檢測引物及探針，所述牛布魯氏菌檢測引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的下游引物，牛布魯氏菌檢測探 針的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述羊布魯氏菌檢測引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示的下游引物，所述羊布魯氏菌檢測 探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述豬布魯氏菌檢測引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物，所述豬布魯氏菌檢 測探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述犬布魯氏菌檢測引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示的下游引物，所述犬布魯氏菌 檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示，所述牛布魯氏菌檢測探針、羊布魯氏菌檢測 探針、豬布魯氏菌檢測探針、犬布魯氏菌檢測探針標記有熒光報告基團和熒光淬滅基團。 [0011]優選地，所述牛布魯氏菌檢測探針、羊布魯氏菌檢測探針、豬布魯氏菌檢測探針、 犬布魯氏菌檢測探針的5 '端標記有熒光報告基團，3 '端標記有熒光淬滅基團。
[0012] 進一步優選地，所述牛布魯氏菌檢測探針5'端標記的熒光報告基團為FAM熒光基 團，3 '端標記的熒光淬滅基團為BHQ-1。
[0013] 進一步優選地，所述羊布魯氏菌檢測探針5'端標記的熒光報告基團為HEX熒光基 團，3 '端標記的熒光淬滅基團為BHQ-1。
[0014]進一步優選地，所述豬布魯氏菌檢測探針5'端標記的熒光報告基團為Cal Red 610熒光基團，3'端標記的熒光淬滅基團為BHQ-2。
[0015] 進一步優選地，所述犬布魯氏菌檢測探針5'端標記的熒光報告基團為CY5熒光基 團，3'端標記的熒光淬滅基團為BHQ-3。
[0016] 本發明的試劑盒采用多重熒光PCR技術在單管中同時進行牛羊豬犬布魯氏菌的檢 測，根據擴增及檢測情況可分析判斷布魯氏菌感染情況、并對所感染布魯氏菌進行準確分 型。因此，引物及探針的設計是本發明試劑盒的關鍵。
[0017] 基于本發明所述試劑盒是采用多重熒光PCR技術來進行檢測的，所以試劑盒中還 可以包括其他一些PCR所需要的常規試劑，如：dNTP、MgCl 2、PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶、尿 嘧啶-N-糖基化酶(UNG)、PCR緩沖液、無菌水(ddH20)的一種或多種。由于此類PCR常用試劑 均可經市場途徑單獨購得或者自行配置，因此具體需要將哪些試劑裝配入試劑盒，可以根 據客戶實際需要配置，為方便起見，也可全部裝配入試劑盒。
[0018] 所述PCR反應體系中，引物、探針、dNTP、MgCl2、PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶、尿嘧 啶-N-糖基化酶(UNG)、PCR緩沖液、無菌水(ddH20)均為常見組分，其含量亦為常規。
[0019] 所述PCR反應體系可自行配置，也可直接以市售的不含引物及探針的通用PCR反應 液加入引物及探針獲得。例如，所述試劑盒中還可以dNTP、MgCl 2、PCR緩沖液、Taq DNA聚合 酶、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)、無菌水(ddH20)，加入本發明的引物及探針、待檢樣本即可獲 得PCR反應體系。
[0020] 所述試劑盒中還可含有陽性對照。所述陽性對照為含有牛布魯氏菌陽性對照質 粒、羊布魯氏菌陽性對照質粒、豬布魯氏菌陽性對照質粒、犬布魯氏菌陽性對照質粒的溶 液。可單獨市購或根據現有技術自行構建。
[0021] 所述試劑盒中還可含有陰性對照。陰性對照可為各種不含有牛羊豬犬布魯氏菌的 溶液，如PCR反應緩沖液、無菌水(ddH20)、生理鹽水等。
[0022] 本發明的第四方面，提供了前述牛羊豬犬布魯氏菌分型熒光PCR檢測試劑盒的使 用方法，包括如下步驟：
[0023] (1)提取樣品基因組DNA;
[0024] (2)加樣：將樣品基因組DNA、陽性對照或陰性對照分別加入裝有PCR反應體系的 PCR管中，獲得對應的樣品反應管、陽性反應管或陰性反應管，所述PCR反應體系中含有前述 牛羊豬犬布魯氏菌分型熒光PCR檢測引物及探針；
[0025] (3 )PCR反應:反應管置于PCR儀上，設置循環參數，進行PCR反應；
[0026] (4)PCR反應結束后，分析結果。
[0027]步驟(1)中，提取樣品基因組DNA為現有技術。
[0028] 優選地，步驟(3)中，PCR反應的條件設置為：37°C X2min;94°C X2min;再按93°C X 15sec-6(TC X60sec，循環40次。
[0029] 本發明的第三方面，提供了前述試劑盒在制備牛羊豬犬布魯氏菌分型檢測產品中 的用途。
[0030] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
[0031]本發明采用多重熒光PCR檢測試劑盒，設計了牛布魯氏菌檢測引物及探針、羊布魯 氏菌檢測引物及探針、豬布魯氏菌檢測引物及探針、犬布魯氏菌檢測引物及探針，在單個 PCR反應管中同時檢測4種類型的布魯氏菌，能夠在檢測布魯氏菌是否存在的同時對其進行 準確的分型，縮短了實驗周期，提高了檢測效率，為及時檢測并診斷布魯氏菌的類型提供了 有力工具。
[0032]本發明所采用的熒光PCR檢測試劑盒靈敏度高，最低檢出限為lX103c〇py/ml，準 確率及陽性率均高達100%;所用引物和探針均基于GenBank公共數據庫中序列設計，特異 性好;操作簡便，無需對PCR產物進行額外處理。PCR擴增和熒光檢測在同一反應管中進行， 全程處于封閉狀態，大大降低了樣本間交叉污染和環境污染的風險。可直接對各種類型的 樣品進行檢測，無需富集培養。
【附圖說明】
[0033]圖1A:待檢布魯氏菌分型陽性對照品（S1~S4，從左自右分別為SI、S2、S3、S4)在 FAM熒光通道下的擴增曲線。
[0034]圖1B:待檢布魯氏菌分型陽性對照品（S1~S4，從左自右分別為SI、S2、S3、S4)在 HEX熒光通道下的擴增曲線。
[0035]圖1C:待檢布魯氏菌分型陽性對照品（S1~S4，從左自右分別為S1、S2、S3、S4)在 Cal Red 610熒光通道下的擴增曲線。
[0036]圖1D:待檢布魯氏菌分型陽性對照品（S1~S4，從左自右分別為SI、S2、S3、S4)在 CY5熒光通道下的擴增曲線。
[0037] 圖2A:SA陽參以及待檢樣本34-1、34-2、34-3、34-4(從左自右分別為3六陽參以及待 檢樣本SA-1、SA-2、SA-3、SA-4)在FAM熒光通道下的擴增曲線。
[0038] 圖2B: SM陽參以及待檢樣本SM-1、SM-2、SM-3、SM-4 (從左自右分別為SM陽參以及待 檢樣本SM-1、SM-2、SM-3、SM-4)在HEX熒光通道下的擴增曲線。
[0039] 圖2C: SS陽參以及待檢樣本SS-1、SS-2、SS-3、SS-4 (從左自右分別為SS陽參以及待 檢樣本33-1、33-2、33-3、33-4)在〇&11^(1610熒光通道下的擴增曲線。
[0040] 圖2D: SC陽參以及待檢樣本SC-1、SC-2、SC-3、SC-