引物組及其應用、利用該引物組進行棉花種質資源遺傳多樣性分析的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子標記技術領域,特別涉及引物組及其應用、利用該引物組進行棉 花種質資源遺傳多樣性分析的方法。
【背景技術】
[0002] 分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記,是DNA水平 遺傳多態性的直接的反映,能穩定遺傳,可反映生物的個體和群體特征。與其它幾種遺傳標 記一一形態學標記、生物化學標記、細胞學標記相比,DNA分子標記具有的優點是:大多數分 子標記為共顯性,對隱性性狀的選擇十分便利;基因組變異極其豐富,分子標記的數量幾乎 是無限的;在生物發育的不同階段,不同組織的DNA都可用于標記分析;分子標記揭示來自 DNA的變異;表現為中性,不影響目標性狀的表達,與不良性狀無連鎖;檢測手段簡單、迅速。 分子標記是檢測種質資源遺傳多樣性的有效工具,分子標記技術不僅能夠檢測物種內的遺 傳多樣性,而且可以對物種間的遺傳多樣性進行比較。因此利用分子標記進行檢測,選育出 具有外源目標性狀基因、盡可能不帶或少帶不利基因、且遺傳達到平衡的新種質,對現代作 物改良將是十分重要的。
[0003] SSR(Simple sequence repeat,簡稱SSR)也叫微衛星DNA,是建立在PCR基礎上的 第二代分子標記。SSR標記的多態性主要依賴于基本單元重復次數的變異,而這種變異在生 物群體中是大量存在的。與其它標記相比,SSR標記數量豐富,覆蓋整個基因組,揭示的多態 性高;具有復等位基因的特性,提供的信息量大,操作簡便,重復性好,因此已廣泛應用于、 基因組作圖、基因定位、物種親緣關系鑒別、基因庫構建、基因克隆等方面。SSR在棉花基因 組中的分布是十分廣泛的。SSR分子標記技術在棉花種質資源的鑒定上具有非常廣闊的應 用前景。
[0004] 種質資源(germplasm),亦稱遺傳資源(genetic resources)或基因資源(gene resources),它是指一切具有一定種質或基因的生物類型的總稱,棉花種質資源所有的遺 傳物質均存在于各個品種之中,所以我國習慣稱棉花種質資源。我國國家棉花中期庫目前 已搜集整理棉花種質資源8000多份,其中陸地棉有7000多份,這些寶貴的資源材料都保存 在本所的國家中期庫里。
【發明內容】
[0005] 有鑒于此,本發明提供一種引物組及其應用、利用該引物組進行棉花種質資源遺 傳多樣性分析的方法。本發明利用419份有代表性的陸地棉種質資源材料,獲得了 186對條 帶清晰,多態性高,擴增效果好的SSR引物,旨在為棉花種質資源鑒定,遺傳多樣性分析,品 種指紋圖譜的構建等提供核心引物。
[0006] 為了實現上述發明目的,本發明提供以下技術方案:
[0007] 本發明提供了用于陸地棉種質資源鑒定的引物組;
[0008] 所述引物組由上游引物和下游引物組成,如表1所示。
[0009] 本發明還提供了所述引物組在棉花種質資源鑒定中的應用。
[0010] 本發明還提供了所述引物組在棉花種質資源遺傳多樣性分析中的應用。
[0011] 本發明還提供了一種棉花種質資源遺傳多樣性分析的方法,包括如下步驟:
[0012]步驟1:提取獲得樣品的總DNA;
[0013] 步驟2:以步驟1獲得的總DNA為模板,以如權利要求1所述的引物組進行擴增,電泳 檢測,顯色,進行多態性統計分析。
[0014] 在本發明的一些具體實施方案中,棉花種質資源遺傳多樣性分析的方法中所述多 態性統計分析為按〇,1進行統計,用Jaccard系數計算成對品種間遺傳相似性,在遺傳相似 系數基礎上利用非加權平均UPGMA法對所有供試材料建立樹狀圖,相似系數和聚類分析用 NTSYS 2.1軟件完成。
[0015] 在本發明的一些具體實施方案中,棉花種質資源遺傳多樣性分析的方法中步驟2 中所述擴增的 10yL反應體系包括 10 X PCR(含20mM Mg2+) lyL,dNTP( 10mM)0.2yL,Taq酶 (2.5U/yL)0.2yL,去離子無菌水6. lyL,上游引物(5μΜ)0.75yL,下游引物(5μΜ)0.75yL,模板 DNA(50ngAiL)lyL。
[0016] 在本發明的一些具體實施方案中,棉花種質資源遺傳多樣性分析的方法中步驟2 中所述擴增的反應程序為95°C變性2min;94°C變性40s,57°C退火45s,72°C延伸60s,共30個 循環;72°C延伸7min。
[0017] 在本發明的一些具體實施方案中,棉花種質資源遺傳多樣性分析的方法中步驟1 中所述提取為:取棉花葉片針葉一片,放入2mL離心管中,同時裝入一粒鋼珠,放在液氮里冷 凍0.5h;取出離心管放入研磨儀中研磨2次,每次30S;研磨后取出鋼珠,加700ul60 °C水浴預 熱的提取液;60 °C水浴40-60min,每lOmin搖動離心管;取出離心管,加入等體積的氯仿-異 戊醇混合物,氯仿與異戊醇的體積比為24:1,混合;12,000g,離心10min;取上清,置于2ml離 心管,加等體積的氯仿-異戊醇混合物,氯仿與異戊醇的體積比為24:1;混合;12,000g,離心 lOmin;取上清,置于2ml離心管,加0.6倍體積的異丙醇;緩慢顛倒離心管,直至有絮狀沉淀, 靜置lOmin;倒去上清或鉤出DNA到1.5ml的離心管中,用70%乙醇洗2~3次,無水乙醇洗一 次,真空干燥;加500uL TE溶解DNA,保存于-20°C冰箱備用。
[0018] 在本發明的一些具體實施方案中,棉花種質資源遺傳多樣性分析的方法中步驟2 中電泳檢測為:8%的聚丙烯酰胺凝膠。具體順序為:配制凝膠,丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺 (Acr:Bis30)6.7ml,5XTBE 5ml,去離子水((1!120)13.251111,10%厶?(10%過硫酸銨35(^1,四 甲基乙二胺(TEMED)llyl。安裝好電泳槽玻璃,灌膠,待膠凝固后,拔下梳子,灌膠,電泳1個 小時。
[0019] 在本發明的一些具體實施方案中,棉花種質資源遺傳多樣性分析的方法中步驟2 的染色為放在乙酸和無水乙醇及純水配制的固定液里固定7~8min,然后用硝酸銀滲透液 滲透lOmin;純水水洗兩次后放在含有氫氧化鈉、甲醛的顯色液里顯色,直到膠出現棕色帶 為止,最后放在含有無水碳酸鈉溶液中終止。把染好的膠放在觀片燈上照相,按有帶記為1, 無帶記為0進行統計。
[0020] 本發明公開了186對棉花核心SSR引物,平均分配在24條染色體上,這些引物多態 性好,條帶清晰,可以直接用于棉花品種資源的鑒定,遺傳多樣性分析,雜交品種的純度鑒 定,遺傳圖譜的構建等。省去了通常的實驗過程中SSR引物的篩選過程,提高了實驗效率。
[0021] 本發明利用186對SSR核心引物鑒定陸地棉種質資源的方法,實驗操作簡單,結果 好,能有效地區別不同來源背景的種質資源材料,是一種值得推崇的種質資源鑒定的方法。
【附圖說明】
[0022] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案,下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0023] 圖1示24個代表材料對引物NAU3899(靠近M)和NAU4064(遠離M)的篩選結果;其中, 泳道Μ示Marker,泳道1~24分別是材料:冀棉8號,寶山大桃,中棉所12號,無極一枝花,南丹 巴地大花,中棉所16號,秦荔514,蘇遠04-3,軍棉1號,魯原343,中棉所17號,宿棉9108,乍得 3號,非洲棉E-40,澳SiV2,稀絮H10,中棉所81,遼陽多毛棉,岱字棉15號,Ari3697,TM-l,渝 棉1 號,J02-247,中078;
[0024] 圖2示引物NAU1042對419個材料中的1~96號(材料名稱見表3)的擴增圖;從左至 右依次為泳道M、泳道1~96;其中,泳道Μ示Marker,大小依次為:50bp,100bp,150bp,200bp, 250bp,300bp,350bp400bp,500bp;泳道 1 ~96 分別示 1 ~96 號材料;
[0025] 圖3示引物NAU1042對419個材料中的97~192號(材料名稱見表3)的擴增圖;從左 至右依次