與煙草株高發育性狀緊密連鎖分子標記的獲得方法
【技術領域】
[0001] 本發明公開了一種與煙草株高發育性狀緊密連鎖分子標記的獲得方法，屬于煙草 育種和分子遺傳學領域，適用于煙草重要數量性狀主效基因定位、克隆及煙草新品種輔助 選擇育種。
【背景技術】
[0002] 煙草株高是煙草形態建成的最重要性狀，同時煙草的株高也和產量、品質以及非 生物脅迫有密切關系，所以一直是煙草育種改良的重要目標性狀之一。但是煙草株高的遺 傳呈現數量性狀遺傳特征，容易受環境、不同遺傳背景等因素的影響，利用傳統的常規育種 手段來改良煙草株高耗時、費工且選擇不準確，具有一定的局限性。而與傳統方法相比，利 用分子標記可以從DNA水平直接篩選目標材料，彌補傳統育種的局限性，大大縮短育種過 程，因此，通過定位數量性狀位點，發掘與之緊密連鎖的分子標記，進而利用分子標記輔助 選擇來進行煙草形態建成目標性狀改良是一種行之有效的手段。
[0003] 隨著分子標記技術的不斷發展，各種不同的分子標記已經在數量性狀基因座 (QTL)定位和遺傳圖譜構建中被廣泛利用。簡單重復序列（SSR)標記與隨機擴增多態性 (RAPD)、限制性長度差異多態性（RFLP)等分子標記相比具備幾個優勢，它們具有更高的多 態性、更高的密度，而且特別適合煙草這樣的多倍體植物，因此，近幾年，SSR標記已經逐漸 被應用于煙草遺傳圖譜構建和QTL定位研究。
[0004] 基于連鎖分析的QTL定位是研究數量性狀的重要方法之一，其基本原理是利用分 子標記位點與引起表型差異的位點（QTL)之間的重組進行定位。該方法已經在很多重要作 物如水稻、小麥和玉米上廣泛利用，其中，基于連鎖分析理論的極端池分離分析方法（BSA) 是一種快速、高效的方法。其基本原理是根據目標性狀的表型對分離群體進行分組混合DNA 構建極端池，然后在極端池和親本間篩選與目標性狀連鎖的分子標記。
[0005] 關聯分析作圖是另一種研究數量性狀的重要方法，其基本原理是利用引起表型差 異的位點與分子標記間的連鎖不平衡來定位QTL。與連鎖分析相比，在定位QTL方面關聯分 析作圖具有以下優勢：首先，因為關聯分析使用的是自然群體，所以不需要花費時間來構建 人工群體；其次，可以一次檢測多個等位基因變異；最后，精度大，可以達到單基因水平。但 是，關聯分析作圖也存在假陽性較高等缺點。
[0006] 因此，將連鎖分析和關聯分析兩種方法聯合起來進行QTL定位是最理想的研究數 量性狀遺傳的策略，但是，到目前為止，在煙草上利用連鎖分析和關聯分析聯合發掘株高性 狀QTL的方法還未見報道。本發明聯合基于連鎖分析的BSA分析法和關聯分析方法定位與 煙草株高性狀相關的QTL，發掘與主效QTL緊密連鎖的分子標記，為煙草株高發育性狀相關 基因克隆、分子標記開發和新品種培育奠定理論基礎。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于克服現有技術存在的以上問題，提供一種與煙草株高發育性狀 緊密連鎖分子標記的獲得方法，針對煙草株高發育性狀相關基因精細定位、克隆及分子輔 助育種研究在國內外幾乎空白的現狀，利用基于BSA連鎖分析和關聯分析的方法篩選出煙 草株高性狀相關的主效QTL -個或多個，獲得與之緊密關聯的分子標記，為煙草形態發育 相關基因精細定位、克隆及新品種選育奠定基礎，同時也為煙草株高性狀分子輔助選擇提 供可用標記。。
[0008] 為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明通過以下技術方案實現：
[0009] -種與煙草株高發育性狀緊密連鎖分子標記的獲得方法，建立一種獲得煙草株高 發育性狀緊密連鎖分子標記的新方法，包括以下步驟：
[0010] A)煙草株高性狀的表型獲得，供試材料為保存于中國農業科學院煙草研究所"國 家煙草種質庫"中的種質，其中NC82和抗88用作連鎖分析的親本材料，96份煙草種質資 源，包括86份烤煙類型種質、2份白肋煙類型種質、1份雪茄煙類型種質和7份曬晾煙類型 種質作為關聯分析的自然群體，在不同年份和不同地點在始花期調查株高性狀；
[0011] B)基于連鎖分析的煙草主效QTL定位，其中包括：
[0012] 1)采用CTAB方法提取親本和群體基因組DNA，
[0013] 2)根據表型鑒定結果，從F2群體中各選取極端高和極端低的10個單株個體，等量 混合DNA，構建兩個極端池，進而在雙親及兩個極端池間篩選與目標性狀連鎖的SSR分子標 記，鑒定出的標記進一步在整個匕群體（193個單株）中分析基因型，
[0014] 3)主效QTL定位分析，利用F2群體SSR基因型，結合FJPF2 : 3兩年表型數據，進 行QTL定位，利用的分析軟件為Icimapping3. 2，L0D閾值設為2. 5,當某一位點的L0D值大 于2. 5時即認為該處存在一個顯著QTL位點，采用的統計學方法為完備區間作圖法，并估算 相關遺傳參數，相關遺傳參數包括QTL位置、加性效應、對表型變異的加性貢獻率和顯性貢 獻率；
[0015] C)基于關聯分析的煙草株高QTL定位，根據連鎖分析定位結果，在所在區間加密 SSR標記，利用加密的SSR標記分析自然群體，結合連續兩年不同地點的表型數據，進行關 聯分析作圖，首先利用structure. 2對自然群體進行群體結構分析，估算最佳群體組群數 K值，取值范圍2-10 ;將MCMC開始時的不作數迭代設為100000,迭代次數設為100000,采用 定位軟件Tassel4.0-般線性模型（GLM)開展標記與性狀的關聯分析。GLM分析中以Q矩 陣作為協變量進行回歸分析。利用上述方法，首先對相關QTL位點進行關聯分析驗證，同時 進一步縮小QTL所在標記區間位置，發掘影響煙草株高性狀的主效QTL緊密連鎖的分子標 記。
[0016] 進一步的，還包括發掘一個影響煙草株高發育性狀的主效QTL，命名為qPH-12,與 SSR標記PT55174緊密連鎖，位于煙草12號連鎖群區間PT53703-PT60823之間，在F2群體 中可以解釋12. 9 %的表型遺傳變異，在F2 : 3群體中可以解釋13. 8 %的表型遺傳變異，在自 然群體中兩年分別解釋的表型遺傳變異為13. 9%和14. 4%。
[0017] 進一步的，所述與煙草株高發育性狀QTL緊密連鎖的分子標記PT55174,該 標記的上游序列為SEQ ID NO. 1 (TGCTTCCTGCTTCATACGTG)，下游引物序列為SEQ ID NO. 2 (GGCTTGACTTCCATTTAATTTCC)。
[0018] 本發明的有益效果是：
[0019] 本發明建立了一種煙草株高形態發育緊密連鎖分子標記發掘的方法，同時在國際 上首次在煙草12號連鎖群上定位到一個新的影響株高發育的主效QTL，發現一個與之緊密 連鎖的分子標記PT55174。建立的數量性狀主效QTL發掘方法和鑒定的分子標記對煙草株 商主效基因的克隆和新品種選育具有重要意義。
[0020] 1、建立了一種聯合連鎖分析和關聯分析發掘煙草株高發育性狀緊密連鎖分子標 記的方法。
[0021] 2、首次定位到一個和煙草株高性狀相關的主效QTL，為進一步精細定位和克隆相 關基因奠定了很好的基礎。
[0022] 3、獲得一個與煙草株高發育性狀緊密連鎖的分子標記PT55174。在不同群體和不 同環境條件下，該標記與煙草株高發育性狀都存在顯著性關聯，在育種實踐中有很好的應 用前景。
[0023] 上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段， 并可依照說明書的內容予以實施，以下以本發明的較佳實施例并配合附圖詳細說明如后。 本發明的【具體實施方式】由以下實施例及其附圖詳細給出。
【附圖說明】
[0024] 此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解，構成本申請的一部分，本發 明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。在附圖中：
[0025] 圖1為聯合連鎖分析和關聯分析方法確定的煙草株高發育主效QTL位置及與之緊 密連鎖的分子標記。
[0026] 圖中，A表示連鎖分析方法QTL定位結果；B表示關聯分析對主效QTL位點進一步 驗證及與之緊密連鎖的分子標記；"* "表示與煙草株高發育性狀主效QTL緊密連鎖的分 子標記。
【具體實施方式】
[0027] 下面將參考附圖并結合實施例，來詳細說明本發明。
[0028] (一）基于連鎖分析的煙草株高性狀主效QTL發掘
[0029] 1.供試材料
[0030] 以美國引進優質烤煙品種NC82為母本，中國病毒病抗性品種抗88為父本構建Fp F2和F2 : 3人工群體為實驗材料，兩個品種之間在株高發育上存在明顯差異，品種NC82在 營養生長期和生殖生長期株高正常伸長，但是抗88在營養生長期節距幾乎不伸長，呈"蓮 花"狀，在生殖生長期恢復正常；群體構建過程如下：將NC82與抗88配置雜交種Fp匕自 交獲得F 2，分別收獲F2單株，構建F2 : 3株系。
[0031] 2.田間表型鑒定與分析
[0032] 試驗在中國農業科學院即墨試驗基地進行（緯度35. 4,經度119. 3)。第一年，以 NC82為母本，抗88為父本配置雜交組合，收獲匕種子，同期種植匕，進而收獲F2種子。第 二年，在大田條件下種植親本、Fi和F 2群體。親本和每分種植2行，每行25株，3次重復，株 距0. 5