腫瘤靶向藥物相關基因突變高通量檢測方法、引物及試劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本申請涉及腫瘤基因領域，尤其涉及一種腫瘤靶向藥物相關基因的檢測方法、一 組引物對、一種試劑和試劑盒。
【背景技術】
[0002] 腫瘤是當今威脅人類健康的最大疾病，在中國腫瘤已經超過冠心病、腦中風，成為 第一位死因。傳統的化療治療，殺滅腫瘤細胞的同時，也對患者的機體造成極大的傷害。隨 著分子生物學與細胞生物學的發展，對腫瘤的發生發展機理的了解，分子靶向藥物治療成 為了腫瘤治療的有效措施。靶向藥物針對腫瘤特異性位點，通過在局部維持較高的濃度，提 高針對腫瘤的特異性殺傷力，對正常組織細胞作用較小，避免了化療治療的副作用。
[0003] 靶向藥物與腫瘤基因突變存在關聯性，在選用靶向藥物治療之前，需要確認腫瘤 的基因突變位點，用來指導、選擇靶向藥物，以及預知藥物是否有效。目前傳統的腫瘤靶向 藥物相關突變基因檢測方法有桑格測序法，熒光定量PCR法，Fish法，micro array等。傳 統的基因突變檢測方法因技術單次只能檢測較少的突變位點，靈敏度低，而引起腫瘤發生 的基因突變眾多，遠多過目前傳統方法單次能夠檢測的能力。因此有必要設計針對腫瘤靶 向藥物有效性的高通量高靈敏度的檢測方法。
【發明內容】
[0004] 針對上述現狀，本申請的目的在于提供一種基于二測測序技術的腫瘤靶向藥物相 關基因突變高通量檢測方法，一組特異性擴增腫瘤靶向藥物相關基因的引物對，一種試劑 和試劑盒。為實現上述目的，本申請提供了一種腫瘤靶向藥物相關基因的高通量檢測方法， 包括檢測受體內腫瘤靶向藥物關聯基因的突變情況，所述腫瘤靶向藥物相關聯基因包括 BRAF，EGFR，KRAS，NRAS，TP53, FGFR3, KIT，PIK3CA，RET，CTNNB1，PTEN11 個基因 120 個腫瘤 藥物相關基因突變位點中的至少一種。
[0005] 進一步的，上述受體內腫瘤靶向藥物相關基因的基因突變情況包括檢測受體內以 下11個基因120個突變位點中至少一組突變位點的突變情況：
[0006] 1) BRAF基因第600號密碼子；
[0007] 2) BRAF基因第597號密碼子；
[0008] 3) BRAF基因第596號密碼子；
[0009] 4) BRAF基因第594號密碼子；
[0010] 5) BRAF基因第469號密碼子；
[0011] 6) BRAF基因第466號密碼子；
[0012] 7)CTNNB1基因第37號密碼子；
[0013] 8)CTNNB1基因第45號密碼子；
[0014] 9) EGFR基因第719號密碼子；
[0015] 10) EGFR基因第747號密碼子；
[0016] 11) EGFR基因第790號密碼子；
[0017] 12) EGFR基因第854號密碼子；
[0018] 13) EGFR基因第858號密碼子；
[0019] 14) EGFR基因第861號密碼子；
[0020] 15) FGFR3基因第248號密碼子；
[0021] 16)FGFR3基因第249號密碼子；
[0022] 17) FGFR3基因第380號密碼子；
[0023] 18)FGFR3基因第391號密碼子；
[0024] 19) FGFR3基因第641號密碼子；
[0025] 20) FGFR3基因第650號密碼子；
[0026] 21) KIT基因第557號密碼子；
[0027] 22) KIT基因第559號密碼子；
[0028] 23) KIT基因第576號密碼子；
[0029] 24) KIT基因第642號密碼子；
[0030] 25) KIT基因第816號密碼子；
[0031] 26) KRAS基因第146號密碼子；
[0032] 27) KRAS基因第117號密碼子；
[0033] 28) KRAS基因第61號密碼子；
[0034] 29) KRAS基因第13號密碼子；
[0035] 30) KRAS基因第12號密碼子；
[0036] 31) NRAS基因第146號密碼子；
[0037] 32) NRAS基因第117號密碼子；
[0038] 33) NRAS基因第61號密碼子；
[0039] 34) NRAS基因第13號密碼子；
[0040] 35) NRAS基因第12號密碼子；
[0041] 36)PIK3CA基因第542號密碼子；
[0042] 37) PIK3CA基因第545號密碼子；
[0043] 38) PIK3CA基因第546號密碼子；
[0044] 39) PIK3CA基因第549號密碼子；
[0045] 40) PIK3CA基因第1047號密碼子；
[0046] 41) PTEN基因第159號密碼子；
[0047] 42) PTEN基因第233號密碼子；
[0048] 43) PTEN基因第267號密碼子；
[0049] 44) RET基因第918號密碼子；
[0050] 45) TP53基因第306號密碼子；
[0051] 46) TP53基因第273號密碼子；
[0052] 47) TP53基因第248號密碼子；
[0053] 48) TP53基因第245號密碼子；
[0054] 49) TP53基因第175號密碼子。
[0055] 本申請中檢測受體內腫瘤靶向藥物關聯基因的基因突變情況是采用特異性引物 多重PCR擴增及測序步驟的方法進行。
[0056] 進一步的，在所述測序步驟后，包括分析測序結果，即根據所述測序結果選擇腫瘤 革巴向藥物，判斷革巴向的有效性。
[0057] 具體的上述特異性引物多重PCR擴增及測序檢測方法包括以下步驟：
[0058] 1)樣品DNA提取。
[0059] 2)目的基因多重PCR擴增：將樣品DNA與多重PCR擴增試劑混合，同時加入一組 引物對，進行PCR擴增，得到79~190bp長度的目的基因 DNA片段。
[0060] 3)引物酶解：將步驟3所的到的PCR擴增DNA片段，加入引物特異性酶解試劑，降 解去除PCR擴增片段中的引物序列，得到不同長度的DNA片段。
[0061] 4)接頭連接：將步驟3所得到的DNA片段與接頭、特異性標簽、連接反應試劑、 End-repair反應后純化，得到加了接頭的DNA片段。
[0062] 5) PCR擴增：將步驟4獲得的DNA片段加入文庫擴增試劑，進行PCR擴增，得到小 片段DNA文庫。
[0063] 6)文庫均一化：將步驟5獲得的小片段文庫加入額定吸附能力的磁珠，進行純化， 獲得特定濃度的小片段DNA文庫。
[0064] 7)文庫檢測：將步驟6獲得的DNA文庫采用Agilient Bioanalyzer2100檢測文 庫濃度及文庫片段大小。
[0065] 8)高通量測序：對步驟7所得到的文庫進行高通量測序，采用Ion Torrent或者 Ion Proton?測序平臺。
[0066] 進一步的，所述突變位點1-49各自對應的多重PCR擴增的引物對依次為：
[0067] 1-6,引物對17,18,引物序列如表1所述；
[0068] 7-8,引物對4,引物序列如表1所述；
[0069] 9-14,引物對13,14,15,16,引物序列如表1所述；
[0070] 15-20,引物對7,8,9,引物序列如表1所述；
[0071] 21-25,引物對10,11，12,引物序列如表1所述；
[0072] 26-30,引物對23, 24, 25,引物序列如表1所述；
[0073] 31-35,引物對1，2, 3,引物序列如表1所述；
[0074] 36-40,引物對5,6,引物序列如表1所述；
[0075] 41-43,引物對20, 21，22,引物序列如表1所述；
[0076] 44,引物對19,引物序列如表1所述；
[0077] 45-49,引物對26, 27, 28引物序列如表1所述。
[0078] 表1 :多重PCR擴增的引物對
[0079]
[0080]
[0081」 進一步的，具甲步驟1甲的秤曲UNA
提取目胛熘的KKPE秤曲或有胛熘新鲆組織或 者為腫瘤患者胸腔積液。
[0082] 步驟1采用試劑盒提取DNA，DNA提取試劑盒可采用Promega公司的Maxwell 16FFPE Plus LEV DNA Purification Kit (產品號為 AS 1135)，也可使用 Qiagen 公司的 QIAmp DNA FFPE Tissue Kit (產品號為 56404)，也可使用 Invitation公司的MagMAX? FFPE DNA Isolation Kit。
[0083] 步驟 2 米用 Life Technologies 公司的 5X Ion AmpliSeq HiFi Master Mix。
[0084] 步驟3用來酶解引物序列采用Life technologies公司的Fupa reagent。
[0085] 步驟 4 米用 Life technologies 公司的 DNA ligase 與 Ion AmpliSeq Adapters。
[0086] 步驟 5 米用 Life technologies 公司的 Platinum PCR SuperMix HiFi 與 Library Amplification Primer Kit〇
[0087] 步驟 6 米用 Life technologies 公司的 Ion Library Equalizer?。
[0088] 本申請提供了一種試劑，該試劑包括上述引物對，
[0089] 本申請同時還提供了一種包括上述引物對或試劑的試劑盒。
[0090] 本申請的有益效果是：通過單次同時對BRAF，EGFR，KRAS，NRAS，TP53, FGFR3, KIT， PIK3CA，RET，PTEN，CTNNB1等11個基因的120個基因突變情況進行檢測，可以全面的了解 腫瘤藥物相關的基因突變情況，為腫瘤靶向藥物提供用藥指導，并評估靶向藥物的有效性。
[0091] 進一步的，本申請針對 BRAF，EGFR，KRAS，NRAS，TP53, FGFR3, KIT，PIK3CA，RET， CTNNB1，PTEN11個基因的120類突變位點，通過采用以本申請公開的引物進行特異性多重 PCR擴增后進行二代測序的方法，大大提高了腫瘤靶向藥物相關基因突變的檢測靈敏度，提 高了腫瘤突變檢測的通量。
【具體實施方式】
[0092] 進入21世紀，癌癥已經超過冠心病，腦中風等，成為第一死因。目前治療惡性腫瘤 有外科手術，化學藥物治療，放射性治療，免疫治療，靶向藥物治療等。分子靶向治療針對腫 瘤發病機制中的關鍵分子和關鍵位點，選擇性強，毒副作用低，是腫瘤治療的發展方向和新 的突破點。然而，腫瘤的發生機理復雜，突變位點眾多，對腫瘤靶向藥物相關聯基因突變的 篩查是進行靶向藥物治療的前提。美國FDA的腫瘤靶向藥物治療手冊要求使用靶向基因藥 物之前必須進行癌癥突變基因檢測。Sanger測序與熒光定量PCR