一種理性設計的酶用于再生atp的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物化工領域，特別涉及一種理性設計的酶用于再生ATP的方法。
【背景技術】
[0002] ATP是生物體內最重要的高能磷酸化合物，在醫學上被廣泛用作肌肉萎縮、心肌梗 塞、肝炎和各種急救病癥中的治療或重要輔助治療藥物。工業上也有許多重要的生物活性 物質或生化藥物的生物合成過程，也都是需要ATP參加的酶促反應。所以，ATP的生產以及工 業上ATP的循環再生成為酶工程發展的一個重要問題，是決定工業生產是否經濟節約的關 鍵因素。
[0003] 近年來，對ATP再生的研究主要在多聚磷酸激酶催化法，即以ADP和多聚磷酸為底 物，由多聚磷酸激酶催化產生ATP。對于不同來源的多聚磷酸激酶，催化特點各不相同。如 Thermotoga 11^1'；[1:;[1]^來源的多聚磷酸激酶16?口1^是一種嗜熱酶，它的最適溫度為70度，適 合參與溫度較高的反應，但在多數常溫酶的最適溫度(30~37度)條件下酶活較低，不能與 常溫酶的耦合反應，因此不能廣泛的滿足工業生產需求。還有一些多聚磷酸激酶，雖然最適 溫度在30度左右，但是利用的多聚磷酸鹽聚合度較高，這種聚合度高的聚磷酸鹽在當前在 市場上不易得到而且價格昂，這就提高了生產難度和生產成本。另一方面，就工業大量生產 ATP而言，一些多聚磷酸激酶會受到多聚磷酸鹽的抑制，所以大規模生產時不得不采用流加 多聚磷酸鹽的方法來減少抑制，使生產過程變得繁瑣。所以現在亟需找到一種合適的多聚 磷酸激酶，使它既能與許多常溫酶耦合參與工業生產，又能夠使用比較常見且價格低廉的 多聚磷酸鹽為磷酸供體，使ATP再生過程方便、廉價、高效。
[0004] 與公知技術相比，本發明具有以下優點：
[0005] 1)反應最適溫度為30~37度，符合工業生產上多數常溫酶的溫度要求，應用范圍 廣泛。
[0006] 2)磷酸供體為低聚合度的多聚磷酸鹽，相比聚合度為65或者更高聚合度的多聚磷 酸鹽，這些低聚合度的多磷酸鹽價格低廉且常見易得，使ATP再生過程經濟、方便。
[0007] 3)沒有聚磷酸鹽抑制現象，能在較高濃度的多聚磷酸底物作用下高效生產ATP。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的在于提供一種基于蛋白理性設計人工構建的聚磷酸激酶，以低聚合 度的多聚磷酸鹽為磷酸供體，在聚磷酸激酶的催化條件下生成ATP，為多種消耗ATP的酶促 反應源源不斷的提供能量。
[0009] 本發明首先基于一種來自苜蓿中華根瘤菌的多聚磷酸激酶和來自谷氨酸棒狀桿 菌的多聚磷酸激酶的基因序列比對結果，通過基因突變手段理性改造并異源表達了改造后 的來自苜蓿中華根瘤菌的聚磷酸激酶。構建基因工程菌即將改造后的基因 ppk(ket)克隆至 原核表達載體pET22b中得到多聚磷酸激酶基因表達載體pET22b-ppk(ket)。然后將表達載 體轉入大腸桿菌BL21 (DE3)中，IPTG誘導表達，即可在胞內獲得多聚磷酸激酶。
[0010]蛋白表達后，通過超聲破碎將大腸桿菌中的多聚磷酸激酶釋放出來，獲得粗酶液。 在四聚磷酸或其鈉鹽為磷酸供體的條件下，以ADP為底物粗酶液催化產生ATP。
[0011]本發明提供的方法，以ADP為底物，利用價格低廉的四聚磷酸為磷酸供體，理性設 計并異源表達多聚磷酸激酶催化產生ATP，為經濟高效生產ATP并在此基礎上降低多種酶促 反應的成本提供了一種創造性的方法。
[0012]圖1: DNA瓊脂糖凝膠電泳。左側為多聚磷酸激酶基因 ppk (ket)的PCR產物，右側為 DNA大小標準品。
[0013] 圖2:誘導表達改造后的來自苜蓿中華根瘤菌的多聚磷酸激酶PPK蛋白電泳圖。泳 道1為pET22b空質粒表達后破胞上清，泳道2為PPK酶表達后破胞上清。
[0014] 圖3:基因改造后的來自苜蓿中華根瘤菌多聚磷酸激酶動力學參數曲線1
[0015] 圖4:基因改造后的來自苜蓿中華根瘤菌多聚磷酸激酶動力學參數曲線2
[0016] 圖5:苜蓿中華根瘤菌來源的谷胱甘肽合成雙功能酶以PPK催化生成的ATP為能源 酶促產生谷胱甘肽的反應體系。50mM反應體系中添加 20mM ADP時，每隔2h取樣檢測得到的 GSH生成曲線。
【具體實施方式】
[0017] 1.利用Swiss-model程序搜索并比對了一種來自苜蓿中華根瘤菌的多聚磷酸激酶 和來自谷氨酸棒狀桿菌的多聚磷酸激酶的基因序列。
[0018] 2.突變并克隆理性設計后的來自苜蓿中華根瘤菌的多聚磷酸激酶基因。
[0019] 3.誘導表達多聚磷酸激酶PPK。將構建好的重組表達載體質粒pET22b-ppk(ket)轉 入大腸桿菌感受態細胞E.coli BL21(DE3)，在IPTG作用下誘導表達。
[0020] 4.超聲破碎表達菌體，提取粗酶液進行反應。合成反應中的酶添加量采用考馬斯 殼監測蛋白法進行標定。
[0021] 5.酶法合成ATP。在Tris-HCl緩沖鹽體系和輔因子Mg2+存在下，以ADP為底物，四聚 磷酸鹽為磷酸供體，通過多聚磷酸激酶PPK合成ATP。
[0022] 6.酶法合成谷胱甘肽。在Tris-HCl緩沖鹽體系和輔因子Mg2+存在下，以谷氨酸、甘 氨酸和半胱氨酸為底物，四聚磷酸鹽鹽為磷酸供體，通過嗜熱鏈球菌來源的谷胱甘肽合成 雙功能酶(GS)和改造后的苜蓿中華根瘤菌來源的多聚磷酸激酶(PPK)合成谷胱甘肽。
[0023] 7.谷胱甘肽的檢測。采用四氧嘧啶法測定反應液中GSH的含量，在pH 7.2的緩沖條 件下，反應產物與四氧啼啶結合，20min后測定結合物在305nm下的吸光度值。由GSH標準曲 線計算出樣品中GSH的含量。
[0024]下面結合實施例對本發明具體方法進一步說明：
[0025] 實施例1
[0026] 突變并克隆理性設計后的來自苜蓿中華根瘤菌的多聚磷酸激酶基因
[0027] 利用定點突變的方法把來自苜蓿中華根瘤菌的聚磷酸激酶基因 ppk進行突變成 ppk(ket)。以該菌株原始基因重組載體為模板，根據GenBank序列設計引物，按照TaKaRa MutanBEST kit試劑盒說明操作。
[0028]定點突變所用引物如下：
[0029 ] F1:GCGATCAAAGCGACGACGGAAAATATGAACCCCCGCTC
[0030] R1：ACCACCCTTGCCGGCAGCGT
[0031 ] F2:GCGCGCACCGTCGCACTGACGAAACCGA
[0032] R2:GGAGCGGGGGTTCATATT
[0033] 突變后的重組載體片段大小約為6000bp，核酸電泳圖見圖1。
[0034] 實施例2
[0035] 將構建好表達載體即pET22b-ppk(ket)質粒化轉于BL21(DE3)大腸桿菌中，挑菌后 使用LB培養基