一種高通量篩選產生1-脫氧野尻霉素菌株的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種高通量篩選產生脫氧野尻霉素菌株的方 法。
【背景技術】
[0002] 1-脫氧野尻霉素（DNJ)(圖1)是一種哌啶類多羥基生物堿，能夠競爭性結合蔗糖 酶、海藻糖酶、α -葡萄糖苷酶等的底物結合口袋，從而抑制其活性，降低碳水化合物的消化 和葡萄糖的產生，從而達到防治糖尿病的作用。另外，DNJ還具有抗病毒、抗腫瘤轉移等功 效，對于研制糖尿病治療的新藥及開發抗病毒藥物具有非常重要的學術意義和實用價值。
[0003] 天然的DNJ目前在植物（主要為桑科植物）、動物（主要包括家蠶以及食用桑葉 為主的昆蟲）以及微生物（主要為鏈霉菌以及芽孢桿菌）都能夠生成。目前合成DNJ的方 法主要是通過化學合成，以及在生物體內進行合成。鏈霉菌以及芽孢桿菌能夠以葡萄糖為 底物通過異構、轉氨、氧化、還原等步驟合成DNJ，但是從中所分離得到的DNJ的含量極低。 雖然通過基因工程菌手段和定向進化方法可以提高DNJ產量，但是由于缺乏有效的篩選手 段，難以篩選到高效合成DNJ的野生型和基因工程突變體。
[0004] 目前DNJ的檢測主要采用反相高效液相色譜-紫外檢測法，采用9-芴基氯甲酸甲 酯（FM0C-C1)對DNJ進行結構衍生，用熒光檢測器檢測生成的熒光產物，此方法雖然具有重 復性好，穩定性高等優點，但是操作繁瑣、靈敏度低、經過衍生后所得的產物不太穩定等，不 適合測定低濃度，樣品量少的檢測，并且檢測器價格比較昂貴，在應用普及方面受到較大限 制，根本不適合于DNJ高效合成菌株的高通量篩選。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供高通量鑒定高產或低產或不產脫氧野尻霉素菌株的方法。
[0006] 本發明提供的高通量鑒定高產或低產或不產脫氧野尻霉素菌株的方法，包括如下 步驟：
[0007] 1)構建表達DNJ生物合成途徑的重組載體和表達β -半乳糖苷酶的出發菌；
[0008] 所述表達DNJ生物合成途徑的重組載體按照包括如下步驟的方法獲得：將3個 DNJ合成基因共同插入表達載體中，得到表達DNJ生物合成途徑的重組載體；
[0009] 所述3個DNJ合成基因為gabTl基因、yktcl基因和gutBl基因；
[0010] 所述表達β -半乳糖苷酶的出發菌按照包括如下步驟的方法獲得：將表達β -半 乳糖苷酶的基因整合到大腸桿菌染色體上，得到表達β-半乳糖苷酶的出發菌；
[0011] 2)針對任一個所述DNJ合成基因設計易錯PCR擴增引物，并以所述重組載體為模 板，進行易錯PCR擴增，得到相應DNJ合成基因的易錯PCR產物；
[0012] 3)以所述相應DNJ合成基因的易錯PCR產物為引物，所述重組載體為模板，進行 MEGAWHOP PCR，得到MEGAWHOP PCR質粒突變體庫；
[0013] 4)將所述MEGAWHOP PCR質粒突變體庫轉入所述出發菌中，涂平板，得到突變庫平 板；且將所述重組載體轉入所述出發菌中，涂平板，得到野生菌平板；
[0014] 從所述突變庫平板上選取顏色比所述野生菌平板上菌落顏色淺的菌落，即為高產 DNJ 菌；
[0015] 從所述突變庫平板上選取顏色比所述野生菌平板上菌落顏色深的菌落，即為低產 或不產DNJ菌；
[0016] 所述高產DNJ菌為DNJ產量高于野生型菌的菌；
[0017] 所述低產或不產DNJ菌為DNJ產量低于野生型菌的菌；
[0018] 所述野生型菌為將所述表達DNJ生物合成途徑的重組載體導入所述出發菌中，得 到的菌。
[0019] 所述整合按照包括如下步驟的方法進行：將所述lacS基因通過載體pAH156LACS 導入大腸桿菌中，所述載體PAH156LACS為將lacS基因（序列2)插入載體pAH156獲得的 重組載體。
[0020] 上述方法中，步驟1)中，所述DNJ合成基因來源于芽孢桿菌或鏈霉菌；
[0021] 所述3個DNJ合成基因以含有3個DNJ合成基因的DNA片段的形式插入所述表達 載體中；
[0022] 步驟2)中，所述易錯PCR擴增引物為gutBl基因的易錯PCR擴增引物。
[0023] 上述方法中，步驟1)中，所述表達載體為pMAL-P2X ;
[0024] 所述含有3個DNJ合成基因的DNA片段的核苷酸序列為序列表中的序列1 ;
[0025] 所述β -半乳糖苷酶的基因的核苷酸序列為序列表中的序列2 ;
[0026] 步驟2)中，所述gutBl基因的易錯PCR擴增引物由序列表中序列3所示的單鏈 DNA分子和序列表中序列4所τκ的單鏈DNA分子組成。
[0027] 上述方法中，所述大腸桿菌為BW25113。
[0028] 上述方法中，所述方法還包括如下步驟：在步驟4)后重復步驟4)。
[0029] 本發明的另一個目的是提供一種高產DNJ的重組菌。
[0030] 本發明提供的重組菌，為如下1)或2)或3)或4):
[0031] 1)將目的菌的gutBl基因核苷酸序列的第2278位T突變為C得到的菌；
[0032] 2)將目的菌的gutBl基因核苷酸序列的第2895位A突變為G得到的菌；
[0033] 3)將目的菌的gutBl基因核苷酸序列的第3206位G突變為A得到的菌；
[0034] 4)將目的菌的gutBl基因核苷酸序列的第2677位A突變為G得到的菌；
[0035] 所述高產DNJ為高產DNJ的重組菌的DNJ產量高于所述目的菌；
[0036] 所述目的菌為重組菌BW25113LACS/pDNJ5wt，其為將重組載體pDNJ5轉入重組菌 BW25113LACS中得到的目的菌；
[0037] 所述重組菌BW25113LACS為將β -半乳糖苷酶的LACS基因同源重組到大腸桿菌 BW25113中得到的重組菌；
[0038] 所述pDNJ5重組載體為將含有gabTl、yktcl和gutBl的片段插入表達載體 PMAL-P2X中得到的重組載體，其中，含有gabTl、yktcl和gutBl的片段的核苷酸序列為序 列表中序列1。
[0039] 本發明的實驗證明，本發明利用芽孢桿菌源的DNJ合成基因，基于DNJ對半乳糖苷 酶的抑制活性，利用藍白斑原理，設計DNJ的高通量篩選方法，通過設計高通量篩選方法對 DNJ進行高效定量檢測，可以篩選高產DNJ、低產DNJ或者不產DNJ的菌株，提高到了對于不 同產量DNJ菌株篩選效率，節省時間，簡化了篩選步驟。
【附圖說明】
[0040] 圖1為脫氧野尻霉素結構式
[0041] 圖2為解淀粉芽孢桿菌和萎縮芽孢桿菌中DNJ合成途徑
[0042] 圖3為gutBl基因的易錯PCR結果
[0043] 圖4為DNJ突變體庫的構建
[0044] 圖5為DNJ突變體平板復篩
[0045] 圖6為DNJ產量的檢測
【具體實施方式】
[0046] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0047] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0048] 圖2為解淀粉芽孢桿菌和萎縮芽孢桿菌中DNJ合成途徑
[0049] 實施例1、高通量篩選（或鑒定）高產脫氧野尻霉素（DNJ)菌株的方法
[0050] 一、篩選高產DNJ的菌株
[0051] DNJ合成基因為gabTl、yktcl和gutBl (TYB)，根據基因序列設計引物對1 (DNJ-fo r-Ndel:5'-ATACATATGGGGACGAAGGAAATTACAAA-3'，DNJ-rev-SacI:5'-ATATGAGCTCTTACACCA GCTTCGGATCAGATAC-3'）可以用來擴增這三個基因。
[0052] 1、合成DNJ基因的獲得
[0053] 提取萎縮芽孢桿菌ACCC 02297 (中國農業微生物菌種保藏管理中心ACCC 02297) 基因組DNA，用引物對1進行PCR擴增，得到3237bp的PCR產物，為含有gabTl、yktcl和 gutBl的片段（gabTl基因在序列1自5'末端第1-1269位核苷酸，yktcl基因在序列1自 5'末端第1266-2216位核苷酸，gutBl基因在序列1自5'末端第2191-3237位核苷酸）。
[0054] 2、重組載體的構建
[0055] 將上述含有gabTl、yktcl和gutBl的片段經過Ndel和SacI酶切，與經過同樣酶 切的表達載體PMAL-P2X (購自NEB#E8000S)連接，得到重組載體pDNJ5。
[0056] 3、易錯PCR擴增產物的獲得
[0057] 為了提高DNJ活性，合成DNJ所必須的三個酶基因進行易錯PCR突變庫的構建；
[0058] 以突變gutBl基因的引物為例：引物對2(GutB-For : CGTAAGTTATTGGAGGATATAAAGTGA (序列 3)，GutB-rev :CTCTACATAT TCAAGITTGT CGTTA (序列 4))；
[0059] gutBl基因的突變：以重組載體pDNJ5為模板，用引物對2進行易錯PCR擴增收集 1047bp PCR 產物。
[0060] 經0. 8%瓊脂糖凝膠電泳分析檢測，結果如圖3所示，泳道1可見約lkb的特異性 條帶，與預期基因大小一致。
[0061] 經過測序，得到的PCR產物為gutBl發生突變，且突變率達到1-4個堿基/kb。
[0062] 上述易錯PCR擴增的反應體系和反應程序如下：
[0065] 表 2 為
[0063] 表1為易錯PCR擴增的反應體系[0064]
[0066]
[0067]
[0068] 4、MEGAWH0P PCR突變體庫的構建
[0069] 將上述3得到的易錯PCR產物進行膠回收作為大引物，以所提取的質粒pDNJ5為 模板隨后進行megawhop PCR，得到PCR產物（野生型質粒和突變質粒的混合物）。
[0070] 反應體系及反應參數如下表3和表4 :
[0071] 表3為MEGAWHOP PCR突變體庫的構建的反應體系
[0072]
[0073] 表 4 為
[0074]
[0075] 隨后向上述PCR產物中加入1 μ 1的Dpnl酶切lh用于去除野生型質粒pDNJ5,然 后在80°C作用20min將酶進行失活，得到MEGAWHOP PCR質粒突變體庫（突變質粒的混合